肉牛飼用復(fù)合益生菌組合的篩選試驗

左秀峰，左秀麗，楊東英，左可吉

（1.莒南縣畜牧發(fā)展促進中心,山東 臨沂 276600；2.德州學(xué)院，山東 德州 330000；3.莒南縣文疃鎮(zhèn)防檢所，山東 臨沂 276600）

20世紀(jì)80年代以來,青貯秸稈生產(chǎn)推動了養(yǎng)牛業(yè)規(guī)模化發(fā)展，但是散戶因場地小、無技術(shù)難以實施。肉牛強度育肥存在飼料消化不全、酸中毒、秸稈利用率低和藥殘等問題。養(yǎng)殖業(yè)減藥行動推動了科研部門潛心研發(fā)替抗減抗新型微生態(tài)制劑，促進了肉牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。益生菌作為對宿主有益的活性微生物逐漸應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域。如何簡便易行地利用益生菌發(fā)酵秸稈，生產(chǎn)低成本牛飼料，關(guān)系到節(jié)糧養(yǎng)牛業(yè)的高效發(fā)展。本課題優(yōu)選出最佳肉牛飼用復(fù)合益生菌組合，確定了精補料中最佳添加比例。

1 材料與方法

1.1 肉牛飼用復(fù)合益生菌的篩選

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蘭州獸藥研究所研究，選擇可用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的微生物，即酵母菌、芽孢桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和乳酸鏈球菌等6種微生物，在前期研究的基礎(chǔ)上，與德州學(xué)院、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)和國家肉牛體系臨沂實驗站聯(lián)合篩選出酵母菌、乳酸糞腸球菌和芽孢桿菌3種益生菌，經(jīng)不同組合比例、按一定工藝研制出4種飼用復(fù)合益生菌組合，代號分別為 I、II、III、IV。

采用體外培養(yǎng)方法，研究不同飼用復(fù)合益生菌組合對魯西黃牛改良的利雜牛瘤胃體外發(fā)酵的影響。體外培養(yǎng)試驗設(shè)5個組，不添加益生菌的基礎(chǔ)日糧為對照組，4個試驗組分別添加I、II、III和IV號飼用復(fù)合益生菌，在精補飼料中的添加量均為180 mg/kg。

1.1.1 試驗動物及日糧組成。選用2頭體重為（276±13）kg安裝有永久性瘤胃瘺管的健康利雜黃牛，以供瘤胃液的采集測試。試驗期間每天飼喂2次（8∶00和18∶00）,自由飲水。TMR飼料為玉米-豆粕-青貯玉米秸日糧，按照肉牛飼喂量的1.3倍維持需要配制，精粗比為59∶41,基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

每千克預(yù)混料含維生素A20萬單位、維生素D33萬單位、維生素 E600IU、銅 300 mg、鐵 1900 mg、錳1180 mg、鋅 1460 mg、硒 20 mg、碘 30 mg、鈷 9 mg、鈣100～200 g、磷60～90 g及食鹽15%。

1.1.2 體外培養(yǎng)試驗。①產(chǎn)氣量。每隔0.5 h記錄注射器抽取的氣體量，記錄完后排干凈，累計培養(yǎng)24 h的總產(chǎn)氣量。②瘤胃液pH值。培養(yǎng)24 h后立即用微電腦pH-EC-TDS測定儀（青島翌宏儀器有限公司）直接測定。③瘤胃液NH3-N濃度。參照馮宗慈比色法進行測定。④瘤胃液菌體蛋白（MCP）的測定。取經(jīng)預(yù)處理去除原蟲和飼料大顆粒的上清液20 mL，以16000 r/min離心28 min，棄去上清液，沉淀的細菌部分加入15 mL 10%三氯乙酸溶液。混勻，再以4000 r/min離心13 min，取沉淀物加入5%氫氧化鈉溶解，然后稀釋至40 mL。此稀釋液又經(jīng)4000 r/min離心15 min，取上清液在紫外分光光度計上用280 nm和260 nm波進行比色，應(yīng)用以下公式求得細菌蛋白質(zhì)含量：

細菌蛋白含量 （mg/mL）=(1.45×D280-0.74×D260)×稀釋倍數(shù)。

瘤胃液VFA濃度按照賽默飛氣相色譜法進行測定。⑤采用Excel軟件和Spss16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和多重比較顯著性檢驗。

表3 飼用復(fù)合益生菌組合制劑對培養(yǎng)液產(chǎn)氣量、pH值、MCP含量、NH3-N濃度和干物質(zhì)降解率的影響

1.2 II號肉牛飼用復(fù)合益生菌飼喂添加試驗

1.2.1 試驗地點。沂水縣宗盛牛場。

1.2.2 試驗動物及設(shè)計。選擇出生日期接近（3月齡以上）、體重相近的健康犢牛24頭，采用單因子隨機分成4個試驗組，每組6頭。試驗從2018年9月1日開始，試驗期30 d，飼養(yǎng)環(huán)境一致。

1.2.3 試驗動物日糧及飼養(yǎng)管理。所有試驗犢牛在試驗期每日人工哺乳牛奶1 kg，飼喂相同基礎(chǔ)日糧。日飼優(yōu)質(zhì)苜蓿干草3 kg、精料2 kg。試驗分為4組，3個試驗組分別按照精料量添加0.05%、0.10%和0.20%的II號肉牛飼用復(fù)合益生菌，接種拌料，35～45℃發(fā)酵3 d飼喂，對照組不添加。每日飼喂2次，自由飲水。精飼料的主要營養(yǎng)成分見表4。

表4 精飼料主要營養(yǎng)成分（單位：%）

1.2.4 測定生產(chǎn)性能指標(biāo)。①測定指標(biāo)。分別在試驗開始和試驗結(jié)束日早晨空腹稱重，測定體尺指標(biāo)，每日飼喂時觀察犢牛的糞便和尿液，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評分記錄腹瀉情況。

腹瀉頻率 （%）=（腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)）/（試驗頭數(shù)×正試期天數(shù)）×100；

糞便指數(shù)=糞便評分之和/總頭數(shù)。

試驗期內(nèi)每日對每頭犢牛的糞便進行打分，當(dāng)犢牛糞便評分＞2時記為一個腹瀉日；當(dāng)糞便評分為4時，按照牛場治療方案進行治療；每頭犢牛腹瀉1 d記腹瀉1次。②評分標(biāo)準(zhǔn)。1分正常，糞便呈條形或柿餅狀，稍有糞味；2分輕度軟糞，糞便松軟成形，糞臭輕；3分中度腹瀉，糞便呈糊粥狀，不成形，酸臭味，糞水無分離[1]；4分嚴(yán)重腹瀉，糞便呈液狀不成形，糞水有分離，酸臭難聞。

表5 飼喂不同含量II號肉牛飼用復(fù)合益生菌對犢牛生長性能的影響（單位：kg,cm，kg/d）

由表6和表7得知，飼喂不同含量II號肉牛飼用復(fù)合益生菌精料組的各組犢牛均有腹瀉，但是腹瀉程度有一定差別，其中對照組腹瀉頻率和糞便評分最高，0.1%組最低。整體來看，本次選擇的試驗期各組腹瀉發(fā)生的概率都不高。楊東英教授指出，乳酸菌在體內(nèi)產(chǎn)生的弱酸環(huán)境對致病性大腸桿菌、沙門氏菌和葡萄球菌等均有不同程度的抑制作用。枯草芽孢桿菌活菌制劑具有治療犢牛和生產(chǎn)奶牛細菌性腸道疾病的作用，觀察期間未發(fā)現(xiàn)動物不良反應(yīng)[2]。本試驗結(jié)果顯示，添加不同含量肉牛飼用復(fù)合益生菌對犢牛腹瀉都有很好的抑制作用。

表6 飼喂不同含量II號肉牛飼用復(fù)合益生菌對犢牛腹瀉的影響

表7 不同益生菌組對犢牛腹瀉評分

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 生化指標(biāo)

2.1.1 不同飼用復(fù)合益生菌組合體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量、pH值、MCP含量、NH3-N濃度和干物質(zhì)降解率。由表3可知，添加I、II、III、IV飼用復(fù)合益生菌組合和對照組的培養(yǎng)液pH值均在正常范圍內(nèi)。添加I、II、III飼用復(fù)合益生菌組合的24 h總產(chǎn)氣量比對照組有顯著提高（P＜0.05），各處理組間差異不顯著（P＜0.05），但是 II號飼用復(fù)合益生菌組合的產(chǎn)氣量最高為170.40 mL；I、II號飼用復(fù)合益生菌組合產(chǎn)生的微生物蛋白含量極顯著高于其他組（P＜0.01），其中II號飼用復(fù)合益生菌組合的微生物蛋白含量最高達270.38 mg/100 mL，而且顯著高于 I、III、（P＜0.05）。 I、II、III飼用復(fù)合益生菌組合產(chǎn)生的氨態(tài)氮濃度極顯著低于對照組和第IV號組合（P＜0.01），IV 號組合顯著低于對照組（P＜0.05）；II、III號飼用復(fù)合益生菌組合的干物質(zhì)降解率極顯著高于對照組（P＜0.01）。

2.1.2 瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸濃度。對照組、I、II、III、IV總 VFAmmol/L 分 別 為 139.65 ±0.17、144.38 ±0.97、146.01±0.62、145.88±0.11 和 140.71±0.13，II組顯著高于對照組。添加飼用復(fù)合益生菌能夠穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境，促進瘤胃發(fā)酵功能改善。從生化指標(biāo)分析以II號飼用復(fù)合益生菌組合 （50%酵母菌+25%乳酸糞腸球菌+25%芽孢桿菌）效果最佳。

2.2 生產(chǎn)性能

由表5可知，試驗開始時各組犢牛體尺、體重指標(biāo)各組差異不顯著 （P＞0.05）。飼喂復(fù)合益生菌精料后，0.05%組與對照組差異不顯著（P＞0.05），0.1%組和0.2%組體高極顯著高于對照組 （P＜0.01），顯著高于0.05%組（P＜0.05）；0.1%組和 0.2%組胸圍顯著高于對照組（P＜0.05）。試驗期0.1%組日增重最高，顯著高于對照組 （P＜0.05），高出 0.23 kg/d,其次 0.2%組和0.05%菌組，0.05%組較對照組增重率提高17.30%。試驗結(jié)束后 0.1%組和0.2%組體重同樣顯著高于對照組（P＜0.05），其他各組之間差異不顯著（P＞0.05）。研究表明，添加0.1%的II號肉牛飼用復(fù)合益生菌（50%酵母菌+25%乳酸糞腸球菌+25%芽孢桿菌）可顯著提高犢牛瘤胃消化率和全消化道消化率，糞便細膩松軟無臭味，飼喂肉牛飼用復(fù)合益生菌精料對犢牛生長發(fā)育有顯著提高，0.1%組在日增重上顯著高于其他各組。

3 結(jié)論

第一，創(chuàng)新模擬瘤胃菌群環(huán)境，運用篩選益生菌的原理與技術(shù)優(yōu)選出肉牛飼用復(fù)合益生菌組合（50%酵母菌+25%乳酸糞腸球菌+25%芽孢桿菌），飼料干物質(zhì)降解率、MCP含量、產(chǎn)氣量和總VFA濃度顯著提高；顯著降低NH3-N濃度，瘤胃液pH值穩(wěn)定。

第二，犢牛按精補料添加0.1%肉牛飼用復(fù)合益生菌，能夠增強瘤胃消化粗纖維、木質(zhì)素和粗蛋白的能力，緩解酸中毒，對降低犢牛腹瀉有很好的抑制作用；糞便細膩無過料，臭味輕；可顯著提高犢牛生長發(fā)育性能，體尺、胸圍、體高和日增重顯著提高。日增重提高0.24 kg/d，腹瀉率降低70%，增強了抗病力。

第三，肉牛飼用復(fù)合益生菌提高了非常規(guī)粗飼料的利用率，可提高經(jīng)濟效益10%以上，干物質(zhì)排放量減少3.5%，屠宰檢測無藥殘。該成果可促進飼料生產(chǎn)新舊動能轉(zhuǎn)換和節(jié)糧養(yǎng)殖業(yè)增效。