肝硬化門靜脈高壓癥大鼠腸系膜上動脈重構的實驗研究

鄭 磊，林佳昀，張馳豪，趙治鋒，李泓杰，戚曉亮，火海鐘，羅 蒙

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院普外科，上海 200011

門靜脈高壓癥（portal hypertension，PHT）是指由于門靜脈系統的血液循環受阻導致門靜脈壓力（portal pressure，PP）升高，從而出現一系列如脾大、脾功能亢進、血液系統三系減少、直腸和臍周淺靜脈曲張、食管胃底靜脈曲張（esophageal and gastric varices，EGV）、腹水等臨床表現的綜合征[1-3]。在我國，由于肝移植受多方面因素的制約，其尚未被作為治療肝硬化PHT 的主要方式，因此絕大多數病例仍需進行內外科綜合治療[4-5]。所以，針對PHT 發病機制的研究，探索有效的PHT 治療靶點至關重要。

肝臟出現不可逆的硬化是引起PHT 的始動因素[6]。在PHT 中，PP 的逐漸升高可引起門脈系統血管中眾多機械力如內皮拉伸力、血管壁張力和流體剪切應力等的增加，一氧化氮（nitric oxide，NO）產生的增多，進而導致脾大及腸系膜上動脈（superior mesenteric artery，SMA）對縮血管物質的低反應性，從而引起內臟循環血量增多，引發高動力循環綜合征并促進廣泛側支循環形成[7-8]。而動脈重構是由于長期血流動力學參數的改變和機械力作用導致血管結構發生變化，包括動脈壁彈性的快速調節、動脈結構重塑的慢性調節等[9-10]。已有研究[11]表明，肝硬化PHT 患者的腹主動脈發生順應性改變，以管壁變薄、每個截面積細胞數量變少為特征。因此，本研究針對肝硬化PHT 發病機制中的SMA 重構的具體表型進行探討，以期為PHT患者的綜合治療提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 實驗動物、主要儀器及試劑

SPF 級 健 康 雄 性Sprague-Dawley 大 鼠26 只[ 由 上海杰思捷實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證：SCXK（滬）2018-0004]，體質量為250 ～300 g。該大鼠飼養于上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物房的標準飼養籠中，實驗動物使用許可證：SYXK（滬）2016-0016。所有大鼠飼以鈷-60 輻照滅菌標準干顆粒飼料，于溫度約25℃、濕度60%～70%、12 h 光照與黑暗交替條件下，自由進食、飲水。本研究根據上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物倫理委員會指導，按照《實驗動物管理條例》對動物進行操作。

四氯化碳（CCl4）（國藥集團化學試劑有限公司），苯巴比妥（Sigma，美國），蘇木精伊紅液、馬松（Masson）染液、天狼星紅（Sirius Red）染液（上海碧云天生物技術有限公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、彈性蛋白抗體、鈣調蛋白抗體、cleaved caspase-3 抗體（Cell Signal Technology，美國），Ki-67 抗體（Abcam，美國），RZ-6240E 四通道生物信號采集系統（上海脈永醫療科技有限公司），全自動生物組織包埋機、凍臺（Leica，德國），正置光學顯微鏡、解剖顯微鏡及成像系統（Nikon，日本），熒光顯微鏡（Zeiss，德國），LEICA RM 2235 切片機（上海徠卡儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組和肝硬化PHT 大鼠模型制備 為觀察肝硬化PHT 不同嚴重程度對SMA 重構表型的影響，本研究將大鼠分為正常對照組（Normal group）8 只、CCl4吸入8周PHT 組（CCl48 w group）8 只、CCl4吸入12 周PHT 組（CCl412 w group）10 只。對于CCl4吸入8 周及12 周組大鼠：將CCl4溶液置入容器中，一邊接入流動空氣，一邊接入飼養籠。大鼠平均每次吸入CCl4的時間為1 ～2 min，前3 周吸入CCl4的時間為3 ～5 min，每周2 次；飲用苯巴比妥水（0.3 g/L）。正常對照組大鼠則采用不給予含CCl4溶液的空氣，每周2 次，正常飲水。后續，可通過檢測3 組大鼠的血流動力學參數、觀察其肝臟的形態及結構，判斷模型構建是否成功。

1.2.2 大鼠血流動力學參數測定 稱重后，用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉3 組大鼠。根據大鼠股動脈搏動情 況確定股動脈走行，在游離股動脈約2 cm 處結扎遠心端，并用動脈夾夾閉近心端。用肝素鈉生理鹽水溶液（100 U/mL）充滿22 G 靜脈留置針后，將其插入股動脈，松開動脈夾，用絲線結扎并固定針管和股動脈近心端，針管另一端則與肝素化的壓力換能器相連，通過RZ-6240E四通道生物信號采集系統讀取并記錄平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）。而后，從正中切口進腹，將肝臟上翻，沿腸系膜找到門靜脈主干，將PE-50 導管平行刺入門靜脈1.5 cm 左右，其另一端與肝素化的壓力換能器相連。平衡10 min 后，通過RZ-6240E 四通道生物信號采集系統讀取并記錄PP。

1.2.3 大鼠SMA 獲取 取出所有大鼠的肝臟組織，雙手游離暴露整段腸系膜環。用血管鉗鉗夾腸系膜與后腹壁連接處，在鉗夾處遠端剪下腸系膜及整段腸管，并將其迅速置入生理鹽水溶液中。隨后，用針頭將其固定于培養皿中的硅膠板上，最大程度地暴露SMA 及其分支。去除淋巴結和脂肪后，緩慢分離SMA，并將中段SMA 置于4%多聚甲醛中，以備后續行免疫組織化學和免疫熒光檢測；剩余部分SMA 保存于液氮中，以備后續行蛋白質印跡（Western blotting）檢測。

1.2.4 相關指標檢測 取上述肝臟組織制備石蠟切片，而后分別行蘇木精- 伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E staining，H-E 染色）、Masson 染色和Sirius Red 染色，以觀察肝臟結構。取上述獲取的SMA 組織制備冰凍切片后行H-E 染色，觀察其血管直徑、血管壁厚度和血管面積。采用免疫組織化學法檢測中段SMA 中鈣調蛋白的表達。采用免疫熒光法檢測中段SMA 中彈性蛋白、cleaved caspase-3 蛋白及Ki-67 蛋白的表達，并采用Western blotting 檢測保存于液氮中SMA 的鈣調蛋白和彈性蛋白的表達。

1.3 統計學方法

應用Image J 軟件定量分析SMA 的血管直徑、血管壁厚度和血管面積等參數，免疫組織化學結果和Western blotting 結果。應用Zessi 2.6 軟件分析免疫熒光結果，并用Image J 軟件定量分析。應用SPSS 20.0 軟件對研究數據進行統計分析，組間兩兩比較采用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝硬化PHT 模型的建立

本研究通過對3 組大鼠進行不同方式的處理后發現：①正常對照組大鼠生長發育良好，毛發有光澤，抓持時皮膚有彈性，掙脫力較大；而CCl4吸入8 周和12 周的肝硬化PHT 組大鼠，隨著吸入時間的增加，毛發變得稀疏，精神逐漸發生萎靡，掙脫力明顯減弱，且部分大鼠產生了明顯的腹水（圖1A）。②正常對照組大鼠肝臟形態規則，表面光滑，顏色紅潤且質地柔軟；CCl4吸入8 周的肝硬化PHT 組大鼠肝臟顏色變灰黃，表面多不規則；而CCl4吸入12 周大鼠的肝臟整體縮小，形態不規則，表面可見顆粒狀結節，顏色變至暗灰色，質地較硬，失去光澤（圖1B）。③經CCl4吸入誘導建模后，與正常對照組相比，CCl4吸入8 周和12 周的肝硬化PHT 組大鼠的PP 升高、MAP 降低（均P＜0.05）（圖1C、D）。

圖1 大鼠肝硬化PHT 模型的建立Fig 1 Establishment of PHT model of liver cirrhosis in rats

對3 組大鼠的肝臟組織的石蠟切片行H-E 染色，結果顯示：3 組組織的細胞核呈藍色、細胞質呈紅色。正常對照組大鼠肝臟組織形態正常，以小葉中央靜脈為中心排列成放射狀細胞條索。CCl4吸入8 周和12 周組大鼠肝臟可見彌漫性肝竇和肝小葉結構的破壞，纖維和膠原組織在匯管區，圓形或類圓形的假小葉形成；其中，CCl4吸入12 周組較8 周組更甚，假小葉內肝細胞成團排列，未見正常肝竇結構，血管及假小葉周圍有炎細胞浸潤。經Masson 染色后，結果顯示：3 組肝臟組織的膠原纖維呈藍色。Sirius Red 染色后結果顯示：3 組肝臟組織的膠原纖維呈紅色，背景黃色。相較于正常對照組，CCl4吸入8 周組和12 周組大鼠的肝臟組織切片可見彌漫性膠原纖維組織廣泛增生，主要分布于假小葉周圍；其中，CCl4吸入12周組較8 周組硬化更加嚴重，同時在肝竇、門脈、肝動脈和中央靜脈周圍有大量的膠原纖維沉積（圖1E）。綜上，大鼠肝硬化PHT 模型構建成功。

2.2 大鼠SMA 重構分析

SMA 冰凍切片經H-E 染色后發現，正常對照組大鼠SMA 彈性較好，鏡下結構正常，分為內皮細胞（endothelial cell，EC）層、平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）層和動脈外壁層。EC 層表面光滑，基底膜完整，細胞間隙之間連接緊密；SMC 層呈梭形排列成束，胞質中可見明顯肌絲；動脈外壁層可見彈性纖維、膠原纖維以及疏松結締組織排列規則。CCl4吸入8 周組大鼠的動脈結構出現損壞，整體血管層次不清，有變薄傾向。在CCl4吸入12 周組，大鼠的血管EC 層基底膜不完整，細胞間隙連接較疏松，SMC 明顯減少，胞質中肌絲少且紊亂，部分肌絲出現斷裂，SMA 明顯變薄（圖2A、B）。經Image J 軟件定量后結果（圖2C ～F）顯示：與正常對照組相比，CCl4吸入12 周組大鼠的SMA 管壁厚度變薄（P=0.000）、管壁厚度和直徑比率下降（P=0.002）及整體血管壁面積減少（P=0.009）；3 組大鼠的SMA 管腔直徑間差異雖無統計學意義，但CCl4吸入12 周組和吸入8 周組較正常對照組略有增加。

2.3 大鼠SMA 中鈣調蛋白表達的檢測

采用免疫組織化學法檢測中段SMA 結構中鈣調蛋白的表達情況。結果（圖3A ～C）顯示，CCl4吸入12 周組較正常對照組的棕色區域明顯減少，即鈣調蛋白表達下降；經Image J 軟件定量后顯示，該差異有統計學意義（P=0.003）。采用Western blotting 檢測剩余SMA 亦得到了同樣的結果（圖3D）。

2.4 大鼠SMA 中彈性蛋白表達的檢測

圖2 大鼠SMA 重構分析Fig 2 Analysis of SMA reconstruction in rats

采用免疫熒光法檢測中段SMA 結構中平滑肌層重要組成成分彈性蛋白的表達。結果（圖4A ～C）顯示：與正常對照組和CCl4吸入8 周組相比，CCl4吸入12 周組大鼠的陽性信號（紅色）較弱，即彈性蛋白表達減少；經Image J 軟件定量后顯示，CCl4吸入12 周組與正常對照組間差異具有統計學意義（P=0.018）。采用Western blotting檢測剩余SMA 亦得到了同樣的結果（圖4D）。

圖3 免疫組織化學法和Western blotting 檢測3 組大鼠SMA 中鈣調蛋白的表達水平Fig 3 Expression levels of caldesmon in SMA among the three groups of rats by immunohistochemistry and Western blotting

2.5 大鼠SMA 中cleaved caspase-3 蛋白、Ki-67 蛋白表達的檢測

圖4 免疫熒光法檢測3 組大鼠SMA 中彈性蛋白的表達水平Fig 4 Expression levels of elastin in SMA among the three groups of rats by immunofluorescence

以cleaved caspase-3 蛋白水平作為凋亡信號，采用免疫熒光法檢測其在3 組大鼠中段SMA 中的表達，結果（圖5A、B）顯示：與正常對照組相比，CCl4吸入12 周組大鼠的中段SMA 中的EC 層、SMC 層和動脈外壁層中的cleaved caspase-3 蛋白表達細胞均有所增加（均P=0.000），即凋亡信號增強，其中以SMC 層增加最為明顯。以Ki-67蛋白水平作為增殖信號，采用上述方法檢測其在各組中段SMA 中的表達，結果（圖5C、D）顯示：與正常對照組 相比，CCl4吸入12 周組大鼠的中段SMA 中各層增殖信號均有所增加，且在EC 層和動脈外壁層中較為顯著（均P=0.000）。

3 討論

圖5 免疫熒光法檢測3 組大鼠SMA 中cleaved caspase-3 蛋白和Ki-67 蛋白的表達水平Fig 5 Expression levels of cleaved caspase-3 and Ki-67 protein in SMA among the three groups of rats by immunofluorescence

肝硬化PHT 的基礎研究主要集中在肝內和肝外兩部分。對于肝內部分，研究旨在緩解肝硬化的進一步發展，減少肝內的纖維生成，降低肝內血管阻力，從而降低PP；對于肝外部分，研究則主要致力于減少內臟血管高動力循環，改善SMA 的血管擴張以及對血管舒張物質的低反應性。本研究結果表明：CCl4誘導的肝硬化PHT 模型不僅存在較高的PP，肝臟結構也出現了硬化改變；同時除了SMA 存在上述血管擴張等功能性改變外，該模型亦存在血管重構等結構性改變。

不僅如此，本研究還發現肝硬化PHT 大鼠SMA 中的鈣調蛋白表達下降，而研究[12]發現依賴鈣調蛋白的肌球蛋白磷酸化作用即粗肌絲調節是血管平滑肌收縮的重要環節。鈣調蛋白是一種多功能的鈣結合蛋白質，含150 個氨基酸，結構相對保守，對鈣具有高度親和性；該蛋白能結合肌動蛋白共存于細肌絲中，還可通過可逆的磷酸化、去磷酸化反應抑制肌球蛋白ATP 活力[13]。在本研究中，SMA 變薄主要發生在血管SMC 層，因此鈣調蛋白表達下降可能是導致血管SMC 層結構和功能變化的關鍵點。上調鈣調蛋白的表達可引起SMA 鈣信號增強以及下游基因轉錄，從而促進血管恢復收縮功能，減緩血管擴張，減輕血管重構對肝硬化PHT 帶來的不利影響。

彈性蛋白是一種既耐酸又耐堿的細胞外高分子基質蛋白[14]。目前已經證明其在腦血管疾病中有重要作用，如腦動脈瘤、動脈粥樣硬化、煙霧病等。彈性蛋白是構成彈性膜或彈性纖維的成分之一，亦是動脈壁的主要成分，具有動脈伸縮、舒張功能，在正常壓力下可支撐血管以拮抗管壁塌陷。同時，該蛋白可減緩血流對血管的沖擊力，從而降低血流阻力、剪切力、循環應變力等，在彈性動脈中起到穩定血流的作用[15]。此外，彈性蛋白還具有調控SMC 和穩定動脈構筑的功能[16]。研究[17]發現，大鼠的主動脈彈力層由6 ～10 層彈性蛋白構成，而人主動脈則由40 ～70 層構成。離體和在體實驗[18]表明，物理因素（包括血壓、血流、外傷等）、細胞因子、生長因子、藥物和激素等均可影響動脈彈性蛋白的合成。本研究發現其在肝硬化PHT 的SMA 中同樣發生大面積減少，繼而提示SMA 重構與彈性蛋白相關。所以，肝硬化PHT 大鼠SMA中彈性蛋白的合成減少，將會引起血管壁的變薄、收縮功能的減弱，從而加劇PHT 的發展。因此，增加以彈性蛋白為主要結構的平滑肌層，應當成為改善PHT 動脈重構的關鍵。

本研究發現肝硬化PHT 的SMA 血管壁存在不同程度的凋亡和增殖，但SMC 層凋亡信號較強且差異具有統計學意義。正常血管與淋巴管一樣，由EC 層、SMC 層和血管外壁層共同組成，存在一定的滲透壓，能夠維護組織穩態，具有較好的屏障作用。而在本研究中，肝硬化PHT大鼠SMA 的動脈血管的結構與功能發生變化，與正常對照組間存在較大差異。因此，動脈壁的變薄，尤其是凋亡增多導致SMC 層的急劇減少，各功能蛋白和收縮蛋白表達下降，肝外SMA 形態和結構逐步類似淋巴管，均可能是肝硬化PHT 患者腹水增多的原因。

綜上所述，肝硬化PHT 的肝外SMA 存在血管重構變薄現象，且相關收縮結構蛋白如鈣調蛋白、彈性蛋白的表達均急劇下降，平滑肌層凋亡增多，受損嚴重。因此，如何調控PHT 的動脈重構對其血流動力學參數的影響，從而降低PP、緩解肝硬化PHT 的發生與發展將是我們未來研究的重點；同時，對該方向的深入探討也或可為肝硬化PHT 患者的外科綜合治療提供新的思路。

參·考·文·獻

[1] 鄭磊, 羅蒙. 肝硬化門靜脈高壓癥的基礎研究進展[J]. 肝膽胰外科雜志, 2019, 31(4): 254-257.

[2] Bosch J, Groszmann RJ, Shah VH. Evolution in the understanding of the pathophysiological basis of portal hypertension: how changes in paradigm are leading to successful new treatments[J]. J Hepatol, 2015, 62(1): S121-S130.

[3] Iwakiri Y, Shah V, Rockey DC. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis: current status and future directions[J]. J Hepatol, 2014, 61(4): 912-924.

[4] Iwakiri Y. Pathophysiology of portal hypertension[J]. Clin Liver Dis, 2014, 18(2): 281-291.

[5] Gracia-Sancho J, Maeso-Díaz R, Fernández-Iglesias A, et al. New cellular and molecular targets for the treatment of portal hypertension[J]. Hepatol Int, 2015, 9(2): 183-191.

[6] Fernandez M. Molecular pathophysiology of portal hypertension[J]. Hepatology, 2015, 61(4): 1406-1415.

[7] Tsochatzis EA, Bosch J, Burroughs AK. Liver cirrhosis[J]. Lancet, 2014, 383(9930): 1749-1761.

[8] 鄭磊, 孫隆慈, 羅蒙. 肝硬化患者門靜脈壓力及靜脈曲張評估進展[J]. 肝膽胰外科雜志, 2016, 28(3): 255-258.

[9] Ho HL, Huang HC. Molecular mechanisms of circulatory dysfunction in cirrhotic portal hypertension[J]. J Chin Med Assoc, 2015, 78(4): 195-203.

[10] Seo YS, Shah VH. Pathophysiology of portal hypertension and its clinical links[J]. J Clin Exp Hepatol, 2011, 1(2): 87-93.

[11] Resch M, Wiest R, Moleda L, et al. Alterations in mechanical properties of mesenteric resistance arteries in experimental portal hypertension[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2009, 297(4): G849-G857.

[12] Sharma RK, Parameswaran S. Calmodulin-binding proteins: a journey of 40 years[J]. Cell Calcium, 2018, 75: 89-100.

[13] Moreno-Vinasco L, Garcia JGN. Receptor tyrosine kinase inhibitors in rodent pulmonary hypertension[J]. Adv Exp Med Biol, 2010, 661: 419-434.

[14] Clift PF, Cervi E. A review of thoracic aortic aneurysm disease[J]. Echo Res Pract, 2020, 7(1): R1-R10.

[15] Vindin H, Mithieux SM, Weiss AS. Elastin architecture[J]. Matrix Biol, 2019, 84: 4-16.

[16] Santos M, Serranoducar S, Gonzalezvaldivieso J, et al. Genetically engineered elastin-based biomaterials for biomedical applications[J]. Curr Med Chem, 2020, 25(40): 1-28.

[17] Rossmann P, Lácha L, Lodererová A. Morphology and immunohistochemistry of rat aortic grafts[J]. Folia Microbiol, 1999, 44(3): 339-353.

[18] Lund PK. The α-smooth muscle actin promoter: a useful tool to analyse autocrine and paracrine roles of mesenchymal cells in normal and diseased bowel[J]. Gut, 1998, 42(3): 320-322.