非擴增性干細胞治療理念的形成及其應用前景

戴尅戎

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院骨科，上海 200011

非擴增性干細胞治療技術是通過非體外培養、非細胞增殖的方式，從組織或組織液中直接獲取干細胞，通過物理方式或依靠細胞本身的特性濃縮聚集干細胞（如離心、富集等），直接應用或與材料混合后回植患者體內，進行細胞治療。該類技術具有耗時短、污染可能性小、倫理問題少等優勢。其中，利用骨髓間充質干細胞本身黏附特性的干細胞篩選-富集-復合循環系統[screen-enrich-combine（-biomaterials） circulating system，SECCS]作為一種非擴增性干細胞治療技術，已經用于230 余例臨床的骨修復病例，療效滿意[1-4]。

自20 世紀下葉起，人體干細胞的研究和應用逐步成為熱點，干細胞多能性和無限增殖能力備受關注，特別是多能干細胞應用技術越來越多地受到相關科學家和臨床醫生的重視，被認為具有巨大的研究價值和應用潛力。干細胞可望治療多種疾病，在組織再生和延緩衰老方面將發揮重要作用，是一種可以改變現代治療模式的新型技術，可以帶來巨大的經濟價值和社會貢獻。1999 年，Science 雜志將人類胚胎干細胞研究成果評為當年世界十大科技進展之首。但是，近20 年來，干細胞的應用研究發展并未加速。其中一個重要因素是倫理問題。胚胎干細胞等相關的核轉移技術涉及人源性祖細胞，受到廣泛質疑甚至反對。相對而言，成體干細胞的應用獲得多數學者的認可。但這同時也存在一些難以回避的問題。傳統技術通過干細胞分離、培養、誘導，從而得到有效數量的干細胞，這通常需要在分離干細胞之后通過體外培養以擴增干細胞數量。但體外培養過程時間久、操作繁瑣，并且存在干細胞干性下降、污染等一系列問題。更重要的是，體外培養擴增往往需要使用動物血清，或受到不良的理化因素影響而出現非二倍體的細胞。因此，在應用上一直受到倫理學限制。

細胞治療實質上是通過將某些特定細胞輸注患者體內，通過歸巢效應，或直接植入特定區域，利用細胞特性形成組織、修復器官，以治療相關的臨床疾病。21 世紀以來，隨著人們對細胞研究的深入，細胞治療也不斷發展。目前，細胞治療已開始應用于不少臨床領域，如利用嵌合抗原受體T 細胞療法（chimeric antigen receptor T cell therapy，CAR-T）治療急性淋巴細胞白血病和淋巴瘤[5]，應用胰島細胞移植治療1 型糖尿病，應用角膜緣干細胞移植修復角膜，應用神經干細胞移植治療腦外傷和帕金森病，應用骨髓間充質干細胞促進骨軟骨再生修復長節段骨缺損，應用施萬（Schwann）細胞、神經干細胞或祖細胞、嗅鞘細胞、少突膠質細胞前體細胞或間充質干細胞治療脊髓損傷[6]等。而人類多能干細胞的發現更是有望從根本上重塑再生醫學和人類對復雜疾病的研究，目前已開展多項有關人誘導多向潛能干細胞的相關臨床試驗[7]。

傳統干細胞治療技術包括樣本采集，干細胞分離、培養、移植等過程。而通過干細胞分離得到的干細胞數量往往較少，因此需要體外培養擴增以獲得足量細胞數。利用Ficoll 或Percoll 等分離液的密度梯度離心法，是實驗室常用的從骨髓血中分離骨髓單個核細胞（包含骨髓間充質干細胞）的方法。研究人員應用該方法分離骨髓單個核細胞并用于臨床研究[8]。而為了得到足量的骨髓間充質干細胞，則需進一步通過體外培養。這時除了上述細胞體外培養的常見問題外，密度梯度離心所需的分離液等相關試劑毒性，也成為干細胞治療過程中的阻礙。因此，如何規避這些繁瑣步驟，直接獲得足夠數量的干細胞用于臨床治療，成為細胞治療向前發展的重要挑戰之一，這也正是發展非擴增性干細胞治療技術的由來。

離心技術是細胞治療最常用的一種非擴增性方式。獲取的組織或組織液，通過離心濃縮富集獲得組織中的干細胞成分，但往往還混有一些其他細胞。如直接一起應用，有時也起到一定的相輔相成作用[2]。離心分離是最早期常用的非體外培養干細胞富集技術。離心技術包括差速離心和密度梯度離心。差速離心根據大小不同的細胞在同一介質中沉降所需流速不同以分離不同的細胞。一般適用于分離大小懸殊的細胞。而密度梯度離心則是借助離心力作用形成一系列連續或不連續的密度梯度不同的細胞分層，以達到分離細胞的目的；如COBE 2991（美國Gambro BCT公司）或Celution 系統（美國Cytori 公司）正是通過此原理實現對血液或脂肪組織液中干細胞的分離，而不需要體外培養[9]。但通過離心技術很難實現干細胞的精準 分離。

免疫磁珠分選技術是一種新興技術。免疫技術的發展也為非體外培養干細胞治療技術帶來了新思路。通過免疫磁珠標記具有特異性表面分子的細胞，如標記CD34或CD133 陽性的細胞，再通過磁場中磁力的作用，將標有免疫磁珠的細胞（陽性細胞）或未能標記的細胞（陰性細胞）篩選出來。CliniMACs 系統（德國Miltenyi 公司）就是利用該原理設計出的細胞分離裝置。目前已有相關臨床研究，通過該方法篩選干細胞治療心肌梗死[10-11]。CliniMACs 系統在歐洲一些國家也已用于臨床，但應用“陽性”選擇在分離外周血中造血干細胞時，CD34 細胞復原率較低，僅為60%。美國國立衛生研究院（NIH）輸血醫學部細胞加工實驗室使用抗AC133 的抗體來篩選造血干細胞，抗AC133 抗體選擇的造血干細胞與抗CD34 抗體選擇的細胞群仍存在部分差異，目前尚有許多問題處于研究階段[12]。

SECCS，或稱非擴增性干細胞富集技術，是利用干細胞的黏附特性，將骨髓血循環過濾于多孔生物材料上，達到篩選干細胞并富集-復合于生物材料，隨后回植體內達到修復骨缺損的目的。目前，我們利用該方法已完成相關動物實驗及人體體外實驗[2-3]，隨即在上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院和上海交通大學附屬第一人民醫院進行了相關人體體內臨床研究[4,13-14]，通過對過濾前后細胞特性的分析發現，過濾富集過程并不會影響細胞的凋亡和增殖能力，具有良好的生物安全性。該技術已獲得10 余項國家專利，具有自主知識產權，可在手術同期完成骨髓干細胞采集-篩選-富集-復合生物材料的制備，干細胞數量足以滿足質量需求，術中直接回植，無需體外培養。避免了體外長時間培養、易污染、使用異種血清及相關倫理學問題，臨床療效滿意。目前已應用治療230 多例骨不連、骨缺損、新鮮骨折骨缺損、股骨頭壞死、脊柱關節融合、距骨骨軟骨損傷、良性骨腫瘤切除后的骨修復等需要骨再生的患者[15-16]，結果提示該方法制備的生物活性材料，其骨修復結果不遜于“金標準”自體骨移植的骨修復療效，總體有效率達到95%。

展望干細胞研究與應用的發展，體外培養干細胞治療技術仍是干細胞治療的主要方式。非擴增干細胞治療技術所形成的理念是一種新興技術思路，目前采用這類技術進行臨床研究或臨床治療的報道數量還不多。而隨著對干細胞研究的深入，非體外培養干細胞治療技術憑借其獨特的優勢必將在干細胞治療中獲得一席之地，成為干細胞治療的有效方式之一。非擴增干細胞治療技術直接或間接地通過增加干細胞分離過程中得到的干細胞數量，省去干細胞體外培養擴增的步驟，從而極大程度地降低干細胞治療技術的難度，提高了干細胞治療的安全性，規避了相關倫理學的問題，其應用范圍顯然不僅僅限于骨科。隨著細胞分離技術的發展，新興干細胞分離技術，如微流控技術、流式細胞術、吸附技術、過濾富集技術等，也將成為非體外培養干細胞治療技術的一部分，甚至可以實現細胞的精確分離和定量分離，根據疾病需要，針對性進行細胞治療，達到經濟、有效的治療效果。

參·考·文·獻

[1] Gan YK, Dai KR. Enrichment techniques of autologous bone marrow stem cells for bone regeneration: translational medicine from bench to bedside. In pushing the boundaries of scientific research: 120 years of addressing global issues[J]. Science, 2016, 351(6278 Suppl): 52-54.

[2] Chu WX, Zhuang YF, Gan YK, et al. Comparison and characterization of enriched mesenchymal stem cells obtained by the repeated filtration of autologous bone marrow through porous biomaterials[J]. J Transl Med, 2019, 17(1): 377.

[3] Chu WX, Gan YK, Zhuang YF, et al. Mesenchymal stem cells and porous β-tricalcium phosphate composites prepared through stem cell screen-enrichcombine(-biomaterials) circulating system for the repair of critical size bone defects in goat Tibia[J]. Stem Cell Res Ther, 2018, 9(1): 157.

[4] Gan YK, Dai KR, Zhang P, et al. The clinical use of enriched bone marrow stem cells combined with porous β-tricalcium phosphate in posterior spinal fusion[J]. Biomaterials, 2008, 29(29): 3973-3982.

[5] Gagelmann N, Riecken K, Wolschke C, et al. Development of CAR-T cell therapies for multiple myeloma[J]. Leukemia, 2020, 34(9): 2317-2332.

[6] Assinck P, Duncan GJ, Hilton BJ, et al. Cell transplantation therapy for spinal cord injury[J]. Nat Neurosci, 2017, 20(5): 637-647.

[7] Soldner F, Jaenisch R. Stem cells, genome editing, and the path to translational medicine[J]. Cell, 2018, 175(3): 615-632.

[8] Hare JM, Fishman JE, Gerstenblith G, et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial[J]. JAMA, 2012, 308(22): 2369-2379.

[9] Reinhardt M, Bader A, Giri S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy[J]. Expert Rev Med Devices, 2015, 12(3): 353-364.

[10] Bartunek J, Vanderheyden M, Vandekerckhove B, et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety[J]. Circulation, 2005, 112(9 Suppl): I178-I183.

[11] Tendera M, Wojakowski W, Ruzy??o W, et al. Intracoronary infusion of bone marrow-derived selected CD34+CXCR4+cells and non-selected mononuclear cells in patients with acute STEMI and reduced left ventricular ejection fraction: results of randomized, multicentre Myocardial Regeneration by Intracoronary Infusion of Selected Population of Stem Cells in Acute Myocardial Infarction(REGENT) Trial[J]. Eur Heart J, 2009, 30(11): 1313-1321.

[12] 干耀愷, 戴尅戎, 湯亭亭. 臨床細胞加工與細胞治療[J]. 國際骨科學雜志, 2007, 28(1): 1-5.

[13] Zhuang YF, Gan YK, Shi DW, et al. A novel cytotherapy device for rapid screening, enriching and combining mesenchymal stem cells into a biomaterial for promoting bone regeneration[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 15463.

[14] Chu WX, Wang X, Gan YK, et al. Screen-enrich-combine circulating system to prepare MSC/β-TCP for bone repair in fractures with depressed tibial plateau[J]. Regen Med, 2019, 14(6): 555-569.

[15] 王昕, 干耀愷, 趙杰, 等. 新型骨髓干細胞快速篩選-富集-復合系統治療四肢骨不連[J]. 中華創傷骨科雜志, 2018, 20(2): 93-98.

[16] 儲文祥, 干耀愷, 趙杰, 等. 應用干細胞快速篩選富集技術治療新鮮骨折骨缺損[J]. 中華創傷骨科雜志, 2018, 20(5): 369-375.