miR-101 miR-384在喉癌患者中的表達情況及意義

楊喜科 姜 平 付莉萍

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%。近年來，盡管以手術為主的綜合治療方案使喉癌預后得到改善，但其遠期生存率并未見明顯提高，尤其是伴頸淋巴結轉移者，其5年生存率不足50%[1]。闡明喉癌發生發展的分子機制，探尋分子靶向標志物以實現靶向治療是提高喉癌生存率的關鍵。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是近年發現的非編碼內源性小分子RNA，對基因表達進行轉錄后的負向調控。研究[2-3]顯示，miRNA與多種惡性腫瘤的發生發展緊密關聯。miR-101在肝癌、前列腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達下調，是一種抑癌miRNA，miR-101可通過作用于Mcl-1而發揮抗腫瘤作用[4]。miR-384在多種惡性腫瘤中表達異常，也被認為是一種抑癌miRNA，能夠抑制腫瘤的侵襲、轉移[5-6]。但在喉癌中，miR-101、miR-384表達是否對腫瘤侵襲、轉移有影響，目前尚缺乏相關報道。為此，本研究檢測喉癌組織中miR-101、miR-384表達水平，旨在初步探討喉癌發病的分子機制及潛在治療靶點，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年10月至2014年12月南陽市中心醫院收治的經手術病理證實的104例喉癌患者，均采集新鮮喉癌組織及癌旁正常黏膜組織(距癌組織0.5～1.0 cm)。所有患者術前均未接受放化療及免疫治療。其中，男性94例，女性10例；年齡37～82歲，平均(54.21±7.62)歲；病理類型均為喉磷癌，其中高分化癌62例，中分化癌37例，低分化癌5例；原發部位：聲門上型23例，聲門型70例，聲門下型11例；淋巴結轉移情況：有轉移29例，無轉移75例。TNM分期：II期42例，III期40例，IV期22例。全部標本均于手術切取離體后置入液氮中，轉運至-80℃冰箱中保存。本研究征得醫院倫理委員會批準，所有對象均對研究充分知情，并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 熒光定量PCR儀(美國Thermo Forma公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，PCR引物(南京金斯瑞公司設計合成)，-80℃低溫冰箱(無錫冠亞恒溫制冷技術有限公司)。

1.3 實驗室方法

1.3.1 總RNA的提取 ①組織勻漿：取喉癌組織、癌旁正常黏膜組織各100 mg，放置于EP管中，加入Trizol Reagent 1 mL，冰上操作勻漿至液態。靜置5 min后，4℃環境下離心(12 500 r/min×3 min)。②兩相分離：吸取1.5 mL組織上清液至新的離心管(1.5 mL)中，加入200 μL氯仿，輕輕振蕩EP管，混勻，EP管液體為粉紅色乳狀，室溫靜置5 min，4℃離心(12 000 r/min×15 min)，此時液體分為3層，其中RNA全部溶解于上層水相。③RNA的沉淀：取離心后的上層水相，移至新的EP管(1.5 mL)中，加入異丙醇，充分混勻，靜置10 min，4℃環境下離心(12 000 r/min×10 min)。④RNA的洗滌：吸除上清液，可見EP管底部沉淀有白色物質，加入1 mL無水冰乙醇，輕彈EP管底部使白色沉淀物充分洗滌、振蕩，4℃環境下離心(12 000 r/min×15 min)。離心后肉眼可見EP管底部存在少量白色沉淀物質，將上清液棄掉，將EP管置于超凈臺中20 min，使RNA干燥。⑤RNA沉淀的重新溶解：采用移液槍往RNA沉淀中加RNA-free H2O，反復吹打數次，于55～60℃下孵育10 min。取2 μL溶解液進行RNA測定，將得到的RNA溶解液置于-80℃環境下保存。

1.3.2 qRT-PCR檢測喉癌組織中miR-101、miR-384的表達 采用熒光定量 qRT-PCR法，以兩步法檢測miR-101、miR-384，按逆轉錄試劑盒說明進行反轉錄反應。熒光定量PCR，應用通用的反轉錄條件轉錄目的miRNAs，95℃ 30 s、95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 20 s，40次循環，以U6為內參，參照公式計算miR-101、miR-384的相對表達量。

miR-101引物序列：5’-AAATGTACTGCGCGTGGAGAC-3’；COX-2-Forward 5’-CTGGCGCTCAGCCATACAG-3’，COX2-Reverse 5’-CACCTCGGTTTTGACATGGGT-3’3’，U6-Forward 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，U6-Reverse 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，GAPDH-Forward 5’-CACTGGCGTC TTCACCACCAT-3’，GAPDH-Reverse 5’-GTGCAGGAGGCATTGCTGAT-3’。

miR-384引物序列：5’-GAAGATCTCTTCAAAGTGAACAGCCCAGT-3’，5’-CCCAAGCTTAGCTTCTTGAAGGCTTCCTATG-3’。

1.4 觀察指標 比較喉癌組織及癌旁正常黏膜組織miR-101、miR-384相對表達量；搜集患者臨床資料，比較不同臨床參數(性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、原發部位、腫瘤TNM分期、分化程度、淋巴結轉移)間喉癌組織miR-101、miR-384表達量的差異。

隨訪截至2019年6月，中位隨訪時間38個月(6～60個月)。根據喉癌組織目標基因相對表達量中位數，定義miR-101≤0.56為低表達(n=40)，>0.56為高表達(n=64)；并定義miR-384≤0.45為低表達(n=46)，>0.45為高表達(n=58)，并采用Kaplan-Meier 法分析miR-101、miR-384對喉癌患者預后的影響。

2 結果

2.1 miR-101、miR-384表達比較 與癌旁正常黏膜組織相比，喉癌組織miR-101、miR-384相對表達量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 喉癌組織與癌旁正常黏膜組織miR-101、miR-384相對表達量比較

2.2 喉癌組織miR-101與miR-384表達的相關性分析 Pearson相關分析顯示，喉癌組織miR-101相對表達量與miR-384相對表達量呈正相關(r=0.436，P<0.001)。

2.3 臨床病理參數對喉癌組miR-101、miR-384表達的影響 性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、原發部位、分化程度對喉癌組織miR-101、miR-384的表達無明顯影響(P>0.05)； III～IV期患者喉癌組織miR-101、miR-384表達量低于II期(P<0.05)；有淋巴結轉移患者喉癌組織miR-101、miR-384表達量低于無淋巴結轉移患者(P<0.05)。見表2。

表2 臨床病理參數對喉癌組織miR-101、miR-384表達的影響

續表2

2.4 影響喉癌組織miR-101、miR-384表達的多因素回歸分析 以TNM分期、淋巴結轉移為自變量，以喉癌組患者miR-101、miR-384表達量為因變量，進行多元逐步回歸分析，結果顯示，TNM分期較晚、發生淋巴結轉移與喉癌組織miR-101、miR-384的相對表達量呈負相關。見表3、4。

表3 影響miR-101表達的多元逐步回歸分析

表4 影響miR-384表達的多元逐步回歸分析

2.5 生存分析 miR-101高表達術后5年生存率為84.37%，高于低表達的62.50%(χ2=4.486，P=0.034)；miR-384高表達術后5年生存率為86.21%，高于低表達的60.87%(χ2=7.587，P=0.006)。不同miR-101、miR-384表達水平喉癌患者的生存曲線見圖1、2。

圖1 不同miR-101表達水平喉癌患者的生存曲線

圖2 不同miR-384表達水平喉癌患者的生存曲線

3 討論

miRNA是一類真核生物內源性非編碼單鏈小RNA分子，長19～23個核苷酸。盡管miRNA在人體基因數中僅占2%，卻對30%以上人體基因的表達有調控作用，介導細胞生長、分化及凋亡等多種生物學過程，與多種疾病發生、進展緊密關聯[7]。miR-101被發現在多種惡性腫瘤組織中呈低表達，其低表達與腫瘤發生、發展呈正相關關系，且低表達miR-101癌癥患者生存率較低[8]。研究[9-10]表明，miR-101在惡性腫瘤中有著強大的抑癌基因功能。Zhou等[11]研究顯示，miR-101可通過抑制細胞因子信號轉導抑制因子 2表達而抑制胃癌細胞的生長。Ye等[12]研究發現，miR-101可通過下調趨化因子12表達而抑制肺癌發生發展。劉健等[13]研究表明，miR-101可通過介導DNA甲基轉移酶3A表達，而對乳腺癌增殖、遷移有抑制作用。本研究顯示，與癌旁正常黏膜組織相比，喉癌組織miR-101相對表達量降低，且臨床分期越晚、伴淋巴結轉移者miR-101相對表達量相對越低，提示miR-101表達下調與喉癌發生、侵襲及轉移密切相關。

目前，已在多種腫瘤中發現，miR表達與腫瘤發生發展密切相關[13]。Chen等[14]研究發現，長鏈非編碼RNA結直腸腫瘤差別表達基因通過抑制miR-384表達促進肝癌細胞的增殖、遷移及侵襲，提示miR-384參與了肝癌的發生發展。miR-384還能靶向抑制蛋白激酶B表達而抑制大腸癌細胞增殖，在多種致癌信號通路中發揮重要調節作用[15]。本研究發現，miR-384在喉癌組織中表達明顯降低，且晚期、有淋巴結轉移者miR-384相對表達量明顯低于早期、無淋巴結轉移者，提示miR-384表達下調，可能參與了喉癌的發生發展，這可能是喉癌發生的重要分子機制，有望成為靶向治療的新靶點。

本研究對miR-101與miR-384的相對表達量進行相關分析顯示，二者呈正相關，二者表達下調可能共同促進了喉癌的發生發展。此外，本研究還對患者5年生存情況與這2基因表達之間的關系進行了分析，結果顯示，miR-101高表達術后5年生存率為83.6%，高于低表達的64.8%；miR-384高表達術后5年生存率為84.1%，高于低表達的65.3%。提示miR-384高表達有利于患者預后。由此推測miR-101、miR-384可能作為判斷喉癌病理進程及預后的新型分子標志物。

綜上所述，miR-101、miR-384在喉癌組織中均呈低表達，與腫瘤發生、侵襲、轉移及預后密切相關，這將有助于深入研究喉癌的發病機制，并為臨床診療提供更多策略及思路。