線粒體異常與卵巢功能不全的相關性研究

于 蕾 紀冬梅

早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指40歲之前月經正常，因卵巢功能衰竭或者不全而出現的持續性閉經等癥狀，直接影響患者生育，增加患者流產率和胎兒染色體畸變率，是卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)的早期階段[1]。目前認為，POI具體發病原因涉及多個方面，但大部分患者的病因仍不確定。據報道[2]，非由化療或放療引起的POI病例中，確定病因的僅占所有病例的20%，大約5%的POI病例為自身免疫性的疾病，15%的病例有明確的遺傳起源，包括染色體異常和/或個體基因突變[3]。而線粒體作為機體細胞工作的“能量工廠”，目前研究[4]認為，其功能異常可能與POI的發病存在著密切聯系，但具體作用機制有待進一步深入研究。本文對線粒體異常與卵巢功能不全發生發展相關的研究進行綜述，旨在從線粒體遺傳的角度解釋POI發生的分子機制，并為POI的風險預測與治療提供更好的方案。

1 線粒體與線粒體DNA

線粒體廣泛存在于除紅細胞以外的真核細胞細胞質內，與各種生命活動需要能量的供給息息相關。卵細胞作為人體內線粒體含量最為豐富的細胞，依賴線粒體獲得發育各個階段所需要的能量。顆粒細胞內也含有大量的線粒體，影響顆粒細胞的分裂代謝、細胞周期以及信號轉導等過程[5]。研究[6-8]發現，線粒體功能失調可能引起顆粒細胞的凋亡，使卵母細胞的生理活動停止，導致卵泡發生閉鎖甚至衰竭，進而引起卵巢儲備功能減退(decreased ovarian reserve,DOR)，而DOR也會對周圍顆粒細胞線粒體生物合成的動態特性產生嚴重影響，形成惡性循環，最終推動POI的進展。

線粒體是半自主細胞器，受細胞核基因組(nuclear DNA,nDNA)與線粒體基因組(mitochondrial DNA，mtDNA)的共同調控。mtDNA是含有16～569個堿基對的環狀DNA分子，編碼呼吸鏈上的13種蛋白、線粒體核糖體中2種rRNA以及22種tRNA共同構成線粒體翻譯機制的一部分。但由于mtDNA沒有組蛋白和染色體結構的保護而極易損傷，mtDNA的突變率遠遠高于核DNA突變率。目前線粒體DNA中超過250個致病性變體和超過300個核基因的突變已經被證明是導致線粒體疾病的重要因素[9-10]。其中與POI發病相關的基因包括MRPS22、POLG、TWNK、LARS2、HARS2、AARS2、CLPP、和LRPPRC等，這些基因在線粒體DNA復制、基因表達、蛋白質合成和降解中起著重要作用。

2 線粒體遺傳異常與POI

2.1 mtDNA拷貝數異常與POI的聯系 由于卵細胞內每個線粒體含有1～2個mtDNA,所以為了方便計算線粒體數目，通常用mtDNA 的拷貝數來反映線粒體數目。線粒體在卵巢衰老中的病理生理作用研究[7，11]表明，線粒體DNA與卵母細胞質量緊密相關，卵母細胞mtDNA拷貝數低，反映了卵母細胞成熟過程中線粒體含量低，細胞器生物基因不足，是卵母細胞質量差、能力差的重要指標，進而預示著胚胎發育不良。在成熟的卵細胞中，mtDNA拷貝數最高，受精后隨著胚胎發育，拷貝數逐漸降低，直到達到一個平臺期[12]。研究[13]表明，高細胞拷貝數的mtDNA允許致病性mtDNA突變與正常mtDNA共存，通常致病性mtDNA突變只有在高于一定閾值水平時才會引起疾病。例如，負責線粒體基因組復制的線粒體DNA聚合酶γ催化亞單位(mitochondrial DNA polymeraseγ，POLG)的突變可導致mtDNA缺失和/或mtDNA缺失累積，部分POLG突變的女性患者存在POI的臨床表現[14-15]。Twinkle-mtDNA螺旋酶(twinkle mtDNA helicase,TWNK)是mtDNA復制所需的核心因子之一，研究[16]表明Twinkle基因編碼的解旋酶的高變異率也會影響mtDNA復制過程，可引起一系列遺傳性疾病，如Perrault綜合征。線粒體DNA控制區(又稱D-loop區，displacement loop region)是線粒體DNA中的一段非編碼區，D-Loop 區是重鏈的復制起點以及重、輕鏈的轉錄啟動子所在的位置,是γDNA 聚合酶與轉錄因子結合的區域 ,調控mtDNA的復制與轉錄[17-19]。研究[20-24]發現，線粒體DNA D-Loop區的變異和腫瘤、糖尿病等疾病的關系密切，而且D-loop區突變率遠高于mtDNA編碼區。導致D-loop區變異率高的原因可能有兩個，一是該區進化速度相對較快，是線粒體DNA序列和長度變異最大的區域；二是mtDNA通過該區與線粒體膜結合，與mtDNA相比，Dloop區更易受到脂質過氧化物的損害。因此，猜測D-loop 區高突變與POI可能存在一定關系。此外，有實驗[25-26]發現，mtDNA D-loop 區的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能會影響mtDNA的復制和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)關鍵蛋白的轉錄，導致電子傳遞鏈(electron transfer chain，ETC)和線粒體功能的變化，造成功能不足，從而導致 mtDNA 損傷、活性氧(reactive oxygen species)過量產生和異常能量代謝，進而影響卵母細胞一系列的發育過程。目前對于POI與線粒體Dloop區的相關研究比較少，尚需進一步探索。

2.2 mt-DNA基因突變與POI的聯系 多項研究[27-28]發現，mt-tRNA基因的突變/變異與多種臨床疾病相關，包括非營養不良性肌強直、肥厚性心肌病、視力喪失等。這種致病性突變可導致RNA轉錄和翻譯缺陷，導致線粒體呼吸鏈功能受損[29]。為了觀察mt-tRNA突變/變異體與POI之間的關系，Ding等[30]對50例POI患者和30例年齡匹配的健康女性進行了mt-tRNAs突變分析，經過聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction，PCR)擴增和直接測序分析，發現存在5種突變：tRNALeu(UUR) C3303T, tRNAMet A4435G, tRNAGln T4363C, tRNACys G5821A 和 tRNAThr A15951G。根據臨床和生化數據，在POI進展過程中，這些突變可能改變tRNALeu(UUR)、tRNAMet、tRNAGln、tRNACys和tRNAThr的二級或三級結構[32-34]，破壞tRNA中高度保守的堿基對的穩定性，使tRNA代謝失敗，最后導致線粒體翻譯缺陷[31]。因此，研究者們認為這5種突變可能導致mt-tRNAs代謝的衰竭以及tRNA穩態水平或氨基酰化能力下降，最終導致線粒體功能紊亂，參與POI的發病。這為探究POI的分子機制提供了新思路，但針對輕度線粒體功能障礙，mt-tRNA基因突變本身不足以產生臨床表型，有待進一步大樣本研究。

2.3 編碼線粒體核糖體蛋白的基因異常與POI的聯系 Chen等[35]在兩個獨立的近親家庭的4名青春期POI女性中發現了核基因編碼線粒體核糖體蛋白S22(MRPS22)純合子錯義變異體，他們對研究對象先后進行全基因外顯子組測序(Whole Exome Sequencing,WES)以及Sanger測序，發現MRPS22(p.R202H)變異是與POI表型分離的唯一氨基酸變化。隨后研究者通過建立小鼠和果蠅兩個動物模型來研究MRPS22突變對卵巢組織的影響，將MRPS22基因敲除后發現，MRPS22基因缺陷小鼠的胚胎致死率顯著增高，并且發現卵巢體細胞中MRPS22的丟失不會改變細胞活力或卵巢發育，但生殖細胞中MRPS22基因敲除，會導致雌性不孕;果蠅模型中，MRPS22基因缺陷對其生育和卵巢發育(致病性強)均存在有害影響。除MRPS22外，線粒體翻譯涉及的其他核蛋白突變與卵巢發育受損也有關。編碼線粒體亮氨酸tRNA合成酶(leucyl-tRNA synthetase 2，LARS2)以及線粒體組氨酸tRNA合成酶(histidyl-tRNA synthetase 2，HARS2)的基因突變導致Perrault綜合征，女性患者可有卵巢早衰表現[36-37]；線粒體tRNA合成酶(Aminoacyle-tRNA synthetases，AARS2)突變導致進行性白質腦病伴卵巢功能衰竭[38]；真核起始因子2B(eukaryotic initiation factor 2B，EIF2B)是參與真核細胞翻譯起始的重要蛋白質,其突變也可以導致卵巢營養不良，甚至卵巢功能衰竭[39]。綜上，種種研究表明，涉及線粒體翻譯的許多基因突變與卵巢發育之間的因果關系突顯了線粒體翻譯在卵巢組織中的關鍵作用。線粒體蛋白質參與機體氧化磷酸化、三羧酸循環、脂肪酸氧化等多種病理生理過程，其結構、功能的改變與POI的發病有密切關系。

3 線粒體氧化磷酸化障礙與POI的聯系

在細胞色素c氧化酶亞基中，MT-CO1、MT-CO2和MT-CO3由線粒體基因組編碼,MT-CO1是主要的催化亞單位。研究[41-42]表明,過度表達 MT-CO1基因的細胞中產生的活性氧類是介導凋亡和 DNA損傷途徑相關基因差異表達的關鍵效應因子，即細胞色素C氧化酶1(mitochondrial cytochrome oxidase I，MT-CO1)基因的高表達水平與卵母細胞成熟有關。Chaffari等[43]發現，POI患者MT-CO1突變的發生率增加，提示MT-CO1基因突變可能會導致POI的發生。MT-CO1基因突變,引起OXPHOS障礙，導致ATP產生減少,ATP不足可影響卵母細胞內PI3K/mTOR通路，導致卵母細胞雷帕霉素復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)活性升高,原始卵泡池提前激活[44-46]，從而加速卵泡發育和卵泡丟失，這會導致成年早期卵泡的衰竭，最后形成POF。根據自由基學說,線粒體氧化磷酸化過程中會產生自由基和活性氧(reactive oxygen species，ROS)。研究[47]表明,適量的ROS在卵母細胞的發育過程中產生一定的積極影響。但當機體不能代謝這些毒性產物時，大量的自由基和ROS堆積可對細胞產生有害影響，包括:①導致線粒體形態發生變化，如膜通透性增加、嵴結構破壞、小線粒體碎片數量增加等[48-49]；②產生內質網應激反應，釋放Ca2+增加，ROS進一步積累，導致線粒體功能障礙[50]；③過高的ROS可以破壞卵巢顆粒細胞，使卵泡黃體化，誘導顆粒細胞凋亡[51]。同時，由于mtDNA缺乏保護并且與ETC位置相近，自由基和ROS可誘導mtDNA的氧化損傷,導致mtDNA突變的概率大幅度增加[52]，從而影響mtDNA編碼的呼吸鏈相關蛋白的合成，形成惡性循環。

4 POI的相關預測和治療

4.1 mtDNA拷貝數的檢測 卵母細胞和胚胎發育過程中，mtDNA拷貝數是線粒體功能的生物標志物之一[53]。卵母細胞成熟時，胞內mtDNA明顯增加，當mtDNA拷貝數增加到一定程度時，卵母細胞才有受精能力。研究[54]發現,卵母細胞內異常線粒體比例升高和 mtDNA 拷貝數下降，可能會導致線粒體能量代謝障礙，影響卵母細胞發育、受精等過程。Marco等[55]通過實驗證實,POI女性血液細胞mtDNA含量具有顯著改變，血液和卵巢mtDNA/nDNA拷貝數似乎是相關的，所以血液中mtDNA含量的測定可能成為POI風險預測的有用工具。

4.2 保護線粒體功能 線粒體是對各種損傷最為敏感的細胞器之一，最常見的損傷原因是氧化應激。為了應對氧化應激的損害，使用多種抗氧化劑對于改善卵巢功能和卵子質量可能起到一定的作用。目前研究[56-57]提示，添加輔酶 Q10 在一定程度上能提高卵巢功能低減患者的卵巢反應性、排卵率，改善妊娠狀態；維生素E(vitamin E,VE)在整個生殖過程中起著至關重要的作用,與POI關系密切[58]，VE 缺乏可導致機體的氧化能力降低，造成ROS堆積，引起卵母細胞線粒體線粒體異常，最終影響卵母細胞質量。補充VE可增加卵巢卵泡生成、卵母細胞質量、受精率和胚胎發育[59]。褪黑素(melatonin，MT)是維持卵巢正常功能的調節因素之一,可改善不孕女性卵母細胞的氧化應激狀態,提高體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)治療下的受精率,對推進IVF-ET的發展有積極作用[60]；長期給予MT可改善衰老所致卵巢功能不全小鼠的卵巢功能，增加卵泡數量, 減少閉鎖卵泡，提高卵母細胞受精率與囊胚形成率[61]。此外，白藜蘆醇也是改善生殖功能的關注熱點，它是一種具有抗氧化活性的植物抗毒素，通過實驗[62]發現，在貓卵細胞體外受精過程中補充白藜蘆醇可以逆轉氧化應激對卵母細胞的不利影響，為改善體外受精卵的培養條件提供了依據，但具體臨床應用仍有待進一步研究。

4.3 補充正常線粒體 卵母細胞線粒體結構和功能異常可導致卵母細胞代謝障礙，引起POI的發生。研究[63]發現，功能性線粒體移植作為輔助生殖的新療法，可能是提高卵母細胞質量的可行策略。早在1997年,胞質移植技術成功應用于高齡不育患者，說明胞質移植對改善胚胎發育具有積極影響，但因其移植成分復雜、影響因素多、存在安全隱患和倫理糾紛等問題，無法廣泛用于臨床。胞核移植現有兩種方法，一種是指將供體卵子中的細胞核取出并放入受體去核后的卵子中，培育出胚胎；另有一種是電融合法，即將供體的卵細胞與去核的受體卵細胞通過電刺激使之發生融合。但以上方法產生的后代的基因組包含來自親本的核DNA和來自親本以及供體的mtDNA，造成胚胎細胞線粒體的異質性，其安全性有待確定。近些年，自體線粒體移植備受關注，這種方法可以克服所謂“三親”嬰兒的遺傳瓶頸。方叢團隊[63]將自體骨髓間充質干細胞中的線粒體分離并移植到卵母細胞中，獲得滿意的妊娠結局，為解決原發不孕夫婦胚胎質量差及妊娠結局差等問題提供了新思路。但由于自體干細胞很難獲得，更重要的是，轉移線粒體的劑量和質量是決定其成功與否的關鍵，目前從細胞培養中分離和鑒定功能性線粒體的技術不成熟，分離線粒體的數量和功能很難分析。因此，自體線粒體移植的有效性和安全性有待進一步研究[61]。

綜上所述，卵巢功能不全的病因多且復雜，具體相關機制尚未完全發掘。而線粒體異常在卵巢功能不全中所發揮的具體作用也是大眾密切關注的，需要進一步的研究來更好地闡明線粒體對POI的貢獻，從而在未來選擇更多更好的方案來治療POI。