右美托咪定對快速心房起搏后兔心房電生理學特性及Cx43 Cx40表達的影響

朱承選 張東亞

右美托咪定是一種新型高效選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑，多用于圍術期鎮痛和鎮靜。研究[1-2]發現，右美托咪定可明顯減少心臟手術術后房顫(postoperative atrial fibrillation，POAF)的發生率,其機制有待進一步探討。POAF是心臟手術術后的一種常見并發癥，具有較高的致死率和致殘率，其發病率為20%～40%[3]。右美托咪定具有心肌保護作用，可抑制心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)后心律失常的發生[4-5]，但右美托咪定能否在房顫時介導房顫的發生和維持，目前尚不清楚。本研究通過短期快速心房起搏構建房顫模型，研究右美托咪定在房顫時對心房電生理學特性和Cx43、Cx40表達的影響，探討其減少房顫發生的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年新西蘭雄兔24只，體質量1.5～2 kg,由清華大學第一附屬醫院動物實驗室提供(動物合格證號：62009800001228)，于恒溫、恒濕環境飼養48 h,自由獲取食物和水。采用隨機數字表法分為C組、RAP組和RAP+DEX組，每組8只。

1.2 試劑與儀器 K-H液：NaCl 6.92 g、NaHCO32.1 g、KCl 0.35 g、KH2PO40.16 g、MgSO4·7H2O 0.29 g、葡萄糖 2.0 g、CaC120.2 g、蒸餾水1 000 mL,PH 7.35～7.45(國產分析純)；兔抗-Cx40多克隆抗體(Abcam公司，英國)；鼠抗-Cx43單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)；總蛋白提取試劑盒(Vazyme公司，美國)；ECL化學發光檢測試劑盒(Invitrogen公司，美國)；BPA多導生理記錄儀(Hugo公司，德國)；IH-5 Langgendoff灌流裝置(Hugo公司，德國)；激光共聚焦顯微鏡(zeiss公司，德國)；DF-5A電生理刺激儀(蘇州東方電子儀器廠，中國)。

1.3 Langgendoff離體心臟模型制備、給藥 家兔術前0.5 h予腹腔注射肝素鈉400 IU/kg抗凝，經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，待無睫毛反射與疼痛反射后，迅速開胸取心，置于4℃K-H液中停跳，修剪心臟、暴露主動脈并插管，連接IH-5 Langgendoff灌流裝置進行主動脈逆行恒壓灌注。Langgendoff灌流裝置中，K-H液以95% O2和5% CO2混合氣體飽和，溫度維持在37℃左右，灌注壓維持在60 mmHg左右。分別將EGM電極固定于左右心房壁及心尖，使其緊貼心肌表面，刺激電極固定于右心耳，MAP電極固定于左心房側壁，連接多導生理記錄儀、DF-5A電生理刺激儀，待心臟穩定復跳15 min(T0)后開始實驗，3組分別于灌注第60(T1)、120(T2)和180 分鐘(T3)時記錄90%單相動作電位時程(monophasic action potential duration，MAPD90)，最后留取左心房組織。C組：繼續灌注K-H液180 min。RAP組:繼續灌注K-H液180 min，同時予快速心房起搏(600次/分，脈寬2 ms, 電壓為2倍閾電位)。RAP+DEX組：繼續灌注含右美托咪定50 ng/mL的K-H液180 min，同時予快速心房起搏。

1.4 電生理參數測定 繼續灌注180 min后，以S1S2程序刺激法檢測心房有效不應期(effective refractory period,ERP)，S1S2偶聯間期從基礎刺激周長300 ms開始，刺激比例8∶1,脈寬2 ms，步長-10 ms,刺激電壓為2倍閾電位，至S2不能奪獲心房的最長S1S2間期為ERP,重復3次，取平均值。記錄T3時ERP和MAPD90的比值(ERP/MAPD90)。待恢復竇率后，行周長為100 ms的Burst刺激，持續30 s，共30次，當心房出現不規則電活動時間>2 s即認為誘發出房顫，記錄3組的房顫誘發率和持續時間。

1.5 Western-blot法檢測心房肌細胞Cx43、Cx40總蛋白的表達 將凍存左心房組織用液氮研磨，均漿，加入RIPA裂解液，再加入苯甲基磺酰氟提取總蛋白，用BCA法行蛋白濃度測定。取待測蛋白樣品50 μg，完成SDS-PAGE，轉到NC膜上。5%脫脂奶粉緩沖液溫室封閉1 h,加入稀釋的Cx43、Cx40抗體及GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液清洗后，溫室下加相應Ⅱ抗(1∶10 000)孵育2 h,洗滌瀝干后，加入ECL Plus試劑進行ECL顯影。最后用圖像分析軟件Labworks測定圖片上每個特異性條帶灰度值。

1.6 免疫熒光法檢測心房肌細胞Cx40、Cx43表達及分布 取左心房組織進行常規石蠟包埋、切片，脫蠟后組織抗原微波修復，磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次，固定，破膜，BSA 37%℃封閉30 min，滴加Ⅰ抗(1∶1 000)，置于37℃濕盒內孵育2 h,磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，磷酸鹽緩沖溶液清洗，封片，激光共聚焦顯微鏡掃描觀察。

2 結果

2.1 3組不同時間點MAPD90比較 T1～T3時，3組MAPD90比較，差異有統計學意義(P<0.05)。RAP組MAPD90隨時間的推移有逐漸下降趨勢，組內比較差異有統計學意義(P<0.05)；C組和RAP+DEX組MAPD90均較T0時無明顯變化，組內比較差異無統計學意義(P>0.05)。不同的處理方式和時間對MAPD90有交互作用(P<0.05)。見表1。

表1 3組不同時間點MAPD90比較

2.2 3組T3時ERP和ERP/MAPD90比較 T3時，3組ERP和ERP/MAPD90進行比較，差異有統計學意義(P<0.05)。RAP組ERP和ERP/MAPD90均低于C組和RAP+DEX組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組T3時ERP和ERP/MAPD90比較

2.3 3組房顫誘發率和持續時間比較 3組房顫誘發率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。RAP組房顫誘發率高于C組和RAP+DEX組，差異有統計學意義(P<0.05)。3組房顫持續時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組房顫誘發率和持續時間比較

2.4 心房肌細胞Cx43、Cx40蛋白表達情況比較 3組心房肌細胞Cx43、Cx40蛋白表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)。RAP組Cx43、Cx40蛋白含量低于C組和RAP+DEX組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 3組心房肌細胞Cx43、Cx40蛋白表達情況比較

圖1 心房肌細胞Cx43、Cx40蛋白表達情況

2.5 心房肌細胞Cx40、Cx43的表達與分布 C組：Cx40、Cx43表達清楚，主要位于心肌閏盤處，呈端—端條狀分布，少量分布于心肌細胞側面。RAP組：Cx40、Cx43表達明顯減少，分布無規律，呈點狀分布，側面分布增多。RAP+DEX組：Cx40、Cx43表達相對減少，分布與對照組類似，僅少量分布于心肌側面。見圖2。

圖2 心房肌細胞Cx40、Cx43的表達和分布(×400)

3 討論

POAF是心臟手術術后常見并發癥，是引起術后心力衰竭、血栓形成的重要原因[3]，降低POAF的發生將有益于改善患者預后。臨床研究[1-2,4-7]發現，右美托咪定可明顯減少POAF的發生率，其機制可能與右美托咪定穩定心臟電活動、上調連接蛋白表達等有關。研究[8]表明，短期快速心房起搏即可引起心房重構，導致心房ERP和動作電位時程縮短、Cx43和Cx40表達下調，增加心臟對房顫的易感性和持續性。本實驗采用快速心房起搏構建房顫模型，觀察右美托咪定在房顫時對兔心房電生理學特性和Cx43、Cx40表達的影響，探討其抑制房顫發生的機制。

本研究RAP+DEX組較RAP組的ERP、 MAPD90明顯延長，ERP/MAPD90的比值明顯增大，與相關研究[6-7]結果一致，表明右美托咪定對心臟電生理活動具有穩定作用。ERP/MAPD90的比值反映心肌電異質性，ERP/MAPD90的比值越大，心肌電異質性越小，越不易形成心律失常。心房ERP和MAPD90的非同步性變化引起電異質性改變是房顫的機制之一[9]。本研究中，右美托咪定可明顯抑制快速心房起搏引起的心房電重構，減少了心肌電異質性。房顫誘發率是衡量心房電穩定性重要指標，RAP+DEX組較RAP組房顫誘發率明顯降低，進一步表明右美托咪定在房顫時對心房電活動具有穩定作用，降低了房顫的易感性。Cx43、Cx40是構成心房肌細胞信號傳導的主要成分，其表達和分布變化時會引起心房電激動傳導速度和傳導方向發生改變[10]。研究[11]發現，右美托咪定可抑制IRI后的心肌復極不均一性，穩定心肌電傳導，降低復灌性心律失常的發生，其機制可能與右美托咪定抑制縫隙連接蛋白失偶聯、抑制Cx43表達減少及分布紊亂有關。本研究結果顯示，RAP+DEX組較RAP組Cx43、Cx40表達明顯上調，且分布更規律，表明右美托咪定可抑制房顫時心房肌細胞Cx43、Cx40的表達下調和再分布，這可能是右美托咪定抑制房顫發生的機制之一。

房顫與氧化應激、炎癥反應等密切相關，氧自由基和炎癥介質的增加均可引起心房肌細胞變性、纖維化，改變心肌細胞電生理特性，增加房顫的易感性[3]。右美托咪定和其他α2-腎上腺素能受體激動劑一樣，具有抗氧化應激、抗炎癥反應等作用，在一定程度上有助于抑制房顫的發生[4,12]，Cx43及Cx40表達的變化同樣與氧化應激和炎癥反應有關[13]。本研究中，右美托咪定可明顯抑制快速心房起搏后的心房電重構、Cx43和Cx40的表達下調和再分布，提示右美托咪定抑制房顫的機制可能與其抑制氧化應激和炎癥反應有關，但仍需進一步研究證實。

綜上所述，右美托咪定可抑制房顫時的心房電重構，降低房顫的易感性，其機制可能與其抑制Cx43、Cx40的表達下調和再分布有關。