靶向沉默黑色素瘤細胞Pim-1 基因對其凋亡蛋白表達的影響

崔自重

( 長沙市第三醫院 湖南 長沙 410015)

黑色素瘤是起源于皮膚黑素細胞的常見皮膚腫瘤，具有惡性程度高、轉移快、預后差等特點。隨著該疾病在我國的發病率急速增加，病死率也呈現一定的上升趨勢[1]。黑色素瘤放化療療效欠佳，多以手術切除為主。但單純手術也不能很好提升患者的生存期，分子生物學技術是今后腫瘤治療的主要方向。腫瘤的生物治療通過RNA 干擾或特異性沉默腫瘤誘發基因來影響腫瘤細胞與外基質的黏附，從而抑制腫瘤生長[2]。Pim-1 是一種保守的絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶基因，主要通過磷酸化途徑使底物特異性的失活，從而促進癌細胞的增殖。已有研究發現，Pim-1 在黑色素瘤患者體內表達非常活躍，表明該基因對B16 細胞的生物學行為具有一定影響。

1.材料與方法

1.1 細胞與試劑

2019 年3 月—10 月期間進行實驗研究。人黑色素瘤細胞（B16）由長沙醫學院新型藥物制劑研發湖南省重點實驗室培育基地（平臺編號2016TP1029）提供；新生牛血清購于濟南勁牛生物科技有限公司；凋亡檢測試劑盒和細胞總蛋白提取試劑盒購于上海貝博生物試劑公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）購于Sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購自于國藥集團化學試劑有限公司；Pim-1 抗體（1:1000）、Bax（1:1000）抗體、Bad（1:1000）抗體均購于Abcam 公司（中國）。

1.2 分組方法

取人黑色素瘤細胞，根據是否沉默Pim-1 基因分為對照組和試驗組。對照組（B16 細胞）：取B16 細胞用含有10.0%胎牛血清的RPMI 1640 培養液（含濃度100μ/mL 青霉素、鏈霉素。pH=7.2 ～7.4）在37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養和傳代。試驗組（轉染B16 后沉默Pim-1 基因）：同樣用含有10.0%胎牛血清的RPMI 1640 培養液進行培養，培養條件同對照組。待細胞完全貼壁后，吸出各孔培養液，加入100μL不含牛血清的培養基，再加入Pim-1 基因。感染時間為90min，每15min 輕微晃動培養液一次。90min 后吸出無血清的培養液，置于37℃、5.0% CO2的飽和濕度培養箱中培養和傳代[3-4]。

1.3 數據采集

（1）細胞增殖指數：將B16 細胞按照8000/孔的密度接于22 孔培養板中，每孔5 組，置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養和傳代，試驗組培養5h 后轉染Pim-1 質粒，分別在12h、24h 以及48h 加入MTT（5mg/mL）20ml，繼續培養4h，吸出培養上清液，每孔中加入200mL DMSO，待結晶溶解后測定570nm處的光密度（D）值，按下列公式計算兩組細胞的增殖指數：增殖率（%）=試驗組D 值/對照組（0h）D 值×100%，實驗重復3次[5]。細胞凋亡率：采用Annexin V/PI 染色法測凋亡率。取兩組細胞制成單細胞懸液（細胞密度為1×107個/mL），用PBS 清洗兩次，加入相應比例（1：1000）的Annexin V 抗體避光染色10min，然后加入適量PBS 溶液和PI 染液混勻，流式細胞儀檢測Annexin V 陽性細胞比例，即為細胞凋亡率[6]。

（2）細胞Bcl-2 蛋白質、Bax 蛋白質、Bad 蛋白質的表達量：該三種蛋白質含量檢測均采用Weatern blomng 法檢測，一抗分別為Bcl-2（1:1000）、Bax（1:1000）、Bad（1:1000），二抗為辣根過氧化物酶耦合聯二擾（1:1000）。

1.4 統計學方法

統計學處理數據應用SPSS20.0 統計軟件進行分析。兩組細胞增殖指數、凋亡率、Bcl-2、Bax、Bad 蛋白質含量均采用（±s）描述，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，三個時間點比較采用F 檢驗，而后采用SNK-q 法進行兩兩比較。同一指標三個時間點比較用重復測量方差分析判定差異具體來源（組間、時間、交互）。通過擬合二分類Logistic 回歸方程綜合分析3 種蛋白表達水平對沉默黑色素瘤細胞Pim-1 基因沉默情況的綜合影響。P＜0.001 為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 兩組細胞增殖指數的比較

時間越久，各組細胞的增殖指數顯著下降（P＜0.001）。三個時間點比較，試驗組細胞的增殖指數顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.001）。重復測量F 分析，組間因素（F=113.718，P＜0.001）和時間因素（F=30.045，P＜0.001）對細胞增殖指數的影響有統計學意義，交互因素（F=0.180，P＞0.05）對細胞增殖指數的影響無統計學意義。見表1。

表1 兩組細胞增殖指數的比較（±s）

表1 兩組細胞增殖指數的比較（±s）

注：與24h 比較 a P ＜0.001；與48h 組比較 b P ＜0.001。

組別 n 24h 48h 96h F P試驗組 110 9.15±1.67 4.08±1.14a 1.67±0.35ab 1176.590 ＜0.001對照組 110 13.25±1.95 5.24±1.46a 1.94±0.32ab 1881.185 ＜0.001 t - 280.532 43.138 35.656 - -P - ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 - -

2.2 兩組細胞凋亡率的比較

時間越久，各組細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.001）。三個時間點比較，試驗組細胞的凋亡率顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.001）。重復測量F分析，組間因素（F=150.559，P＜0.001）和時間因素（F=107.547，P＜0.001）對細胞凋亡率的影響有統計學意義，交互因素（F=5.592，P＞0.05）對細胞增殖指數的影響無統計學意義，見表2。

表2 兩組細胞凋亡率的比較（±s）

表2 兩組細胞凋亡率的比較（±s）

注：與24h 比較 aP ＜0.001；與48h 組比較bP ＜0.001。

組別 n 24h 48h 96h F P試驗組 110 1.27±0.53 2.82±0.64a 4.06±0.82ab 933.861 ＜0.001對照組 110 1.11±0.46 1.34±0.58a 1.87±0.60ab 91.473 ＜0.001 t - 3.775 322.981 511.014 - -P - 0.053 ＜0.001 ＜0.001 - -

2.3 兩組細胞Bcl-2、Bax、Bad 蛋白表達含量的比較

試驗組細胞的Bcl-2 蛋白質表達量顯著低于對照組（P＜0.001），試驗組細胞的Bax、Bad 蛋白質表達量顯著高于對照組（P＜0.001），見表3。

表3 兩組細胞Bcl-2、Bax、Bad 蛋白表達含量的比較（±s）

表3 兩組細胞Bcl-2、Bax、Bad 蛋白表達含量的比較（±s）

組別 n Bcl-2 蛋白 Bax 蛋白 Bad 蛋白試驗組 110 1.14±0.31 0.95±0.28 1.18±0.34對照組 110 2.11±0.45 0.66±0.17 0.77±0.13 t-346.614 86.216 139.555 P-＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 Bcl-2、Bax、Bad 蛋白定量檢測對B16 細胞Pim-1 基因沉默情況的綜合影響

3 種蛋白和B16 細胞Pim-1 基因沉默情況擬合的回歸方程有統計學意義（χ2=106.110，P ＜0.001）。3 種蛋白對Pim-1 基因沉默情況綜合影響依次為：Bcl-2 蛋白、Bad 蛋白、Bax 蛋白，見表4。

表4 Bcl-2、Bax、Bad 蛋白定量檢測對B16 細胞Pim-1 基因沉默情況的綜合影響

3.討論

黑色素瘤具有顯著的早期轉移特點，因此手術切除對該腫瘤大部分患者的臨床治療具有極大局限性。生物治療作為一種“綠色療法”，可以靶向性的凋亡腫瘤細胞而調控腫瘤生長。Pim-1 是Pim 家族之一，Pim-1、Pim-2、Pim-3 氨基酸系列具有高度同源性。Pim-1 因能發揮多種生物學功能而被廣泛研究，諸多學者認為其能加速凋亡蛋白Bad 磷酸化而抑制腫瘤細胞發生凋亡，原癌基因Pim-1 在前列腺癌、肝癌、胃癌等多種癌癥中均有高水平表達，因此，靶向調控B16 細胞中Pim-1 活性可能有助于改善黑色素瘤患者預后。

本文發現，向黑色素瘤B16 細胞中轉染Pim-1 質粒能顯著抑制黑色素瘤細胞B16的表達，該結果與Konrad P研究基本一致。進一步進行組間比較分析發現，沉默Pim-1 基因能明顯增強黑色素瘤細胞B16 的凋亡能力。出現這一結果主要可能與Pim-1 的磷酸化作用有關，磷酸酶Cdc25A 是一個正性特異性G1 期調節子，它能使cyclin-CDK 復合物中細胞周期素依賴性激酶上的15 位酪氨酸殘基去磷酸化，使cyclin-CDK 復合物活化，促使細胞周期由G1 期向S 期轉化。Pim-1 蛋白具有高保真性和自身組成性激活突變型，其產物Pim-1 激酶是一個被稱為ATP 錨的活化位點，它的催化結構域覆蓋了從38-290 位的氨基酸區域，這個區域中44-52 位和67 位氨基酸為磷酸鹽結合位點，Pim-1 基因一方面通過磷酸化Cdc25A，增強它的磷酸酶活性，導致細胞凋亡減少、增殖增多，加速細胞周期G2/M 期的進程，最終調控腫瘤的發生和發展。另一方面，可以通過調節Runt 相關轉錄因子的活性來實現Th 細胞分化的調節，Runx 基因家族包括Runx1、Runx2、Runx3 三個成員，是一種轉錄因子家族，通過合成DNA 結合蛋白，從而在細胞增殖和分化過程中發揮重要作用。Pim-1 和Runx 家族轉錄因子共同定位在細胞核內，增加Runx 蛋白的轉錄活性，因而導致黑色素瘤細胞B16 的增殖受到抑制[7-8]。

同時，試驗組細胞的Bcl-2 表達量顯著低于對照組，試驗組細胞的Bax、Bad 表達量顯著高于對照組。Bcl-2 家族是一組通過影響線粒體外膜上通透性轉換通道的穩定性來調控細胞凋亡的蛋白質，包括抑制凋亡基因與促進凋亡基因兩大類，抑制凋亡基因主要有Bcl-2、Bcl-xL 等，通過增加PT 通道的開放來促進細胞凋亡的基因主要有Bax、Bad 等。駱曼[9]指出，靶控Fascin-1 對惡性黑色素瘤細胞亦會產生類似效果，兩個基因是否同效需要后續驗證。Bcl-2 存在于線粒體上，對線粒體膜具有調節功能，線粒體膜通透性轉換孔與Bcl-2 和Bax 之間關系緊密，細胞凋亡是一系列高度調控的半胱氨酸蛋白激酶caspase 級聯反應的結果，由線粒體膜的通透性轉化孔開放直接導致[10]。同時，沉默Pim-1 基因轉染的B16 可以通過抑制Bcl-2 蛋白表達，來促進Bad、Bax 等凋亡分子表達而發揮促凋亡的作用。這說明沉默Pim-2 基因對黑色素瘤細胞B16 的凋亡和增殖影響與其調控Bcl-2 家族相關基因的表達有關[11]。Pim-1 激酶能夠直接磷酸化促凋亡BH3-only 蛋白Bad 上112 位絲氨酸，這是Bad 蛋白的一個失活性守門人位點，Pim-1 激酶通過抑制Bad 蛋白從而間接提高Bcl-2 的活性，穩定線粒體外膜抑制線粒體凋亡蛋白的釋放，促使細胞因子撤出下的存活。還有研究指出，靶向沉默Pim-1 基因會影響Stat3 的泛素化和降解過程，因此Pim-1 激酶對Bad 蛋白的影響可能存在其他間接途徑，后續研究需要進一步探究。研究還發現，靶向沉默黑色素瘤細胞Pim-1 基因沉默后，主要特征蛋白表達影響從高到低依次為：Bcl-2 蛋白、Bad 蛋白、Bax 蛋白。可間接反推，Bcl-2 蛋白精準、定量檢測對黑色素瘤快速篩查可能有一定應用價值。

細胞實驗初步證實了靶向沉默Pim-1 基因對黑色素瘤細胞發生凋亡的短期影響，但是本文亦有一定局限性，受限于時間和經費，納入觀察的細胞株及觀測時間均相對較短。同時，靶向沉默Pim-1 基因在活體動物實驗中將產生何種具體效果，對不同腫瘤細胞增殖情況是否均有等效的抑制效果仍有待觀察。