冬凌草甲素通過調控LncRNA-H19抑制急性髓系白血病細胞增殖和促細胞凋亡研究

單曉英 張祥華 王 巖

山東省莒縣中醫醫院兒科，山東莒縣 276500

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種惡性造血系統疾病，其特征在于骨髓祖細胞/前體分化受損和不受控制的克隆擴增，導致骨髓衰竭和正常造血功能受損[1]。AML是成人中最常見的急性白血病，也是兒童中第二常見的白血病。目前，AML的臨床治療仍以聯合化療為主，但其總體緩解率有限，復發率也偏高。尤其是老年AML患者，確診后的生存期僅5～10個月[2]。腫瘤細胞的增殖與凋亡涉及到細胞基因組學的改變，其中，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）在此過程中發揮著重要作用。因LncRNAs可通過表觀遺傳學[3]、轉錄[4]以及轉錄后調控[5]介導基因的表達調控，近年來成為藥物抗腫瘤作用機制研究的熱點。其中，LncRNA-H19是最早報道的LncRNAs之一，其在大多數成體組織中不表達或低表達，然而，在腦、呼吸系統、消化系統、泌尿系統及生殖系統腫瘤中的表達均呈上升趨勢，且其致癌作用機制因腫瘤不同而存在差異[6]。冬凌草是一種唇形科香茶菜屬植物，產于貴州、四川、廣西等地區，在傳統上常用于清熱解毒、消炎止痛、活血等。冬凌草富含貝殼杉烷二萜、三萜、甾體以及揮發油等成分，尤其是其主要活性成分冬凌草甲素在食管癌[7]、胃癌[8]、結直腸癌[9]、骨肉瘤[10]等惡性腫瘤中表現出良好的抗癌作用且無明顯的毒副作用，因此引起了國內外研究者的廣泛關注[11]。本研究旨在觀察冬凌草甲素對HL-60細胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用機制是否與調控LncRNA-H19相關。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人急性髓系白血病細胞HL-60購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；冬凌草甲素（純度＞98%）購于北京環宇生物技術有限公司，用二甲基亞砜配制成10mmol/L母溶液；胎牛血清、RPMI-1640培養基購于美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素、Lipofectamine 2000、Trizol、RT-PCR試劑盒購于美國Invitrogen公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司；碘化丙錠染料購于美國Sigma公司；兔抗人Caspase-3、兔抗人Bax、兔抗人Bcl-2、兔抗人LC3-Ⅱ、兔抗人Beclin-1單克隆抗體購于美國Cell Signaling公司。

1.2 主要儀器

Real time PCR分析儀購于美國ABI公司；流式細胞儀購自美國Backman公司；電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.3 細胞培養

HL-60細胞在RPMI-1640培養基中常規培養（含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素），培養條件為5%CO2、37℃、飽和濕度。取對數生長期細胞進行實驗。

1.4 細胞轉染

采用Lipofectmine 2000將陰性對照（si-NC組）和LncRNA-H19 siRNA（si-LncRNA-H19組）轉染至HL-60細胞，轉染6h后換新鮮的RPMI-1640培養基繼續培養細胞，直至48h收取細胞，提取RNA檢測LncRNA-H19表達情況。

1.5 LncRNA-H19表達檢測

采用Trizol試劑提取細胞中的總RNA并逆轉錄合成cDNA，用cDNA作為模板合成擴增目的基因，采用β-actin作為內參照基因。反應條件為95℃預變性30s，95℃變性15s，60℃退火35s，共40個循環。LncRNA-H19基因的上游引物序列為：5'-CTACAGCTTACTTCAAGGCCAG-3'；下 游 引 物序列為5'-TCAGAGACAGTCAAGCGGTAT-3'。

1.6 細胞增殖檢測

采用CCK-8法檢測HL-60細胞增殖情況，收集處于對數生長期的HL-60細胞并接種于96孔板上，密度為5×103個細胞/孔。先以溶媒二甲基亞砜作為對照（Control）組，觀察不同濃度冬凌草甲素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）對HL-60細胞增殖的影響；在細胞轉染成功后，用25μmol/L冬凌草甲素處理si-NC組和si-LncRNA-H19組細胞，觀察LncRNA-H19 siRNA對HL-60細胞增殖的影響。培養48h后，每孔加入10μL的CCK8溶液，于37℃持續孵育2h，再用酶標儀在450nm處檢測吸光度。實驗重復3次。

1.7 細胞凋亡檢測

采用流式細胞術法檢測HL-60細胞的凋亡情況，收集處于對數生長期的HL-60細胞并接種于6孔板上，密度為5×105個細胞/孔。先以溶媒二甲基亞砜作為對照（Control）組，觀察不同濃度冬凌草甲素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）對HL-60細胞凋亡的影響；在細胞轉染成功后，用25μmol/L冬凌草甲素處理si-NC組和si-LncRNA-H19組細胞，觀察LncRNA-H19 siRNA對HL-60細胞凋亡的影響。培養24h后收集細胞，以1500rpm離心5min，棄上清液，用PBS漂洗3次，棄上清液。再將細胞重懸浮并分別加入10μL的Annexin V-FITC和5μL的碘化丙錠染料，混勻，于25℃避光反應15min，再加入300μL緩沖液于1h內采用流式細胞儀檢測。

1.8 相關蛋白表達檢測

采用Western Blot法檢測相關蛋白表達水平。收集處于對數生長期的HL-60細胞并接種于6孔板上，密度為5×105個細胞/孔。先以溶媒二甲基亞砜作為對照（Control）組，觀察不同濃度冬凌草甲素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）對HL-60細胞中相關蛋白表達的影響；在細胞轉染成功后，用25μmol/L冬 凌 草 甲 素 處 理si-NC組和si-LncRNA-H19組細胞，觀察LncRNA-H19 siRNA對HL-60細胞中相關蛋白表達的影響。培養24h后收集細胞，用RIPA裂解液處理細胞并采用BCA法定量總蛋白濃度。以每孔30μg上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉液于25℃封閉1h后分別加入 兔 抗 人Caspase-3（1∶1000）、兔 抗 人Bax（1∶1000）、兔抗人Bcl-2（1∶1000）、兔抗人LC3-Ⅱ（1∶1000）、兔抗人Beclin-1（1∶2000）單克隆抗體，于4℃孵育過夜。用TBST漂洗3次后，加入辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG（1∶1000），于37℃孵育30min，用ECL發光劑顯影。采用Quantity One軟件分析條帶灰度值，選擇β-actin作為上樣內參。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.9 統計學分析

采用SPSS21.0統計學軟件處理數據，計量資料以（）表示，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，兩組獨立樣本比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草甲素對HL-60細胞增殖和凋亡的影響

在5.0～25.0μmol/L濃度范圍內，HL-60細胞存活率隨著冬凌草甲素濃度的增加而降低，凋亡率隨著冬凌草甲素濃度的增加而升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 冬凌草甲素對HL-60細胞增殖和凋亡的影響（%）

2.2 冬凌草甲素對HL-60細胞中凋亡和自噬相關蛋白表達的影響

在5.0～25.0μmol/L濃度范圍內，冬凌草甲素呈濃度依賴性地促進Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達，抑制Bcl-2蛋白表達，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 冬凌草甲素對HL-60細胞中凋亡和自噬相關蛋白表達的影響（±s）

表2 冬凌草甲素對HL-60細胞中凋亡和自噬相關蛋白表達的影響（±s）

濃度（μmol/L） n Caspase-3 Bcl-2 Bax LC3-Ⅱ Beclin-1 0（Control） 4 0.70±0.05 0.86±0.05 0.69±0.06 0.60±0.07 0.65±0.06 5.0 4 0.85±0.07 0.71±0.06 0.85±0.07 0.76±0.08 0.85±0.09 10.0 4 0.91±0.11 0.66±0.07 0.92±0.07 0.87±0.09 0.94±0.10 15.0 4 1.04±0.14 0.63±0.07 1.01±0.11 0.92±0.10 0.98±0.12 20.0 4 1.13±0.13 0.60±0.08 1.12±0.09 0.97±0.12 1.13±0.14 25.0 4 1.14±0.15 0.53±0.06 1.42±0.15 1.15±0.14 1.17±0.13 F 6.791 9.532 20.711 9.897 8.977 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 冬凌草甲素對HL-60細胞中LncRNA-H19表達的影響

在5.0～25.0μmol/L濃度范圍內，HL-60細胞中LncRNA-H19 mRNA表達量隨著冬凌草甲素濃度的增加而降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 冬凌草甲素對HL-60細胞中LncRNA-H19表達的影響（±s）

表3 冬凌草甲素對HL-60細胞中LncRNA-H19表達的影響（±s）

濃度（μmol/L） n LncRNA-H19表達0（Control） 4 0.98±0.02 5.0 4 0.92±0.03 10.0 4 0.89±0.04 15.0 4 0.82±0.04 20.0 4 0.68±0.04 25.0 4 0.58±0.04 F 56.131 P＜0.01

2.4 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的HL-60細胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組 比 較，si-LncRNA-H19組HL-60細胞存活率明顯降低，細胞凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的HL-60細胞增殖和凋亡的影響（± s，%）

表4 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的HL-60細胞增殖和凋亡的影響（± s，%）

組別 n 存活率 凋亡率si-NC組 4 46.61±4.25 14.21±1.23 si-LncRNA-H19組 4 37.50±4.04 17.15±1.66 t 2.689 2.462 P 0.036 0.049

2.5 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的凋亡和自噬相關蛋白表達的影響

與si-NC組 比 較，si-LncRNA-H19組HL-60細胞中Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的凋亡和自噬相關蛋白表達的影響（±s）

表5 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的凋亡和自噬相關蛋白表達的影響（±s）

組別 n Caspase-3 Bcl-2 Bax LC3-Ⅱ Beclin-1 si-NC組 4 1.11±0.13 0.57±0.07 1.41±0.11 1.12±0.11 1.19±0.13 si-LncRNA-H19組 4 1.40±0.14 0.42±0.08 1.67±0.11 1.35±0.10 1.43±0.11 t 2.629 2.528 2.713 2.485 2.622 P 0.039 0.045 0.035 0.047 0.039

3 討論

現代動物和細胞實驗表明，中藥提取物在惡性腫瘤的防治中具有許多優勢，如多靶點作用、副作用少等。冬凌草甲素是一種二萜類化合物，大量的研究表明冬凌草甲素通過誘導細胞周期阻滯、誘發代謝失衡、調控細胞通路等途徑而抑制惡性腫瘤進展[12-14]。早在2004年，Liu等[15]報道，冬凌草甲素通過降低端粒酶活性，呈時間和濃度依賴性地抑制HL-60細胞生長，并顯著誘導細胞凋亡。此后，Weng等[16]通過研究證實冬凌草甲素通過抑制miRNA-17和miRNA-20a啟 動HL-60細 胞 凋亡程序。Li等[17]通過研究發現，冬凌草甲素聯合丙戊酸協同抑制HL-60細胞增殖，通過激活內源性凋亡途徑誘導Caspase依賴性凋亡，并引起細胞中Bcl-2/Bax比例下調。本研究通過CCK-8法以及流式細胞術發現不同濃度的冬凌草甲素對HL-60細胞增殖均有一定的抑制作用，并能有效誘導HL-60細胞凋亡，再次證實了冬凌草甲素在急性髓系白血病中具有明顯的抗腫瘤作用。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執行分子，其在接受上游Caspase分子信號后而被激活，通過裂解細胞漿、細胞核底物引起細胞凋亡，與凋亡中的染色質凝集、核固縮以及核碎裂等形態學變化密切相關[18]。Bcl-2家族是另一類調控細胞凋亡的重要分子，其中，抗凋亡成員Bcl-2和促凋亡成員Bax是國內外研究者引用最多的兩個凋亡指標。然而，Bcl-2家族中促凋亡和抗凋亡成員之間比例的異常升高，可導致線粒體外膜通透性增加，刺激膜間隙蛋白釋放，并激活其下游的Caspases級聯反應，從而啟動細胞凋亡程序[19]。將冬凌草甲素作用于HL-60細胞后，細胞中的Caspase-3和Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，因此，可推測冬凌草甲素誘導HL-60細胞凋亡可能與其調控細胞內Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達，激活線粒體凋亡途徑相關。

自噬是真核細胞內廣泛存在的高度保守的生命現象，是細胞在饑餓、缺氧等應激環境中通過自我分解變形、受損或喪失功能的蛋白質和細胞器以維持細胞基因組穩定以及內環境穩態的一種方式，它既是細胞的自我保護機制，也是細胞的程序性死亡機制[20]。LC3-Ⅱ和Beclin-1是應用最多的自噬標志物。LC3-Ⅱ定位于自噬前體和自噬體，可被水解酶水解，其表達水平與自噬體數量成正比，并可反映自噬活性[21]。Beclin-1是自噬基因Ata6的同源基因，介導自噬蛋白定位于自噬泡并促進自噬體的形成與成熟，被視為自噬的直接執行者[22]。Yao等[12]通過LC3-Ⅱ檢測和透射電子顯微鏡分析發現，冬凌草甲素通過抑制p53突變，干擾結直腸癌細胞中的葡萄糖代謝而誘導細胞自噬。葉利洪等[23]報道，冬凌草甲素可誘導人前列腺癌PC-3細胞中自噬相關蛋白Beclin-1表達。在纖維肉瘤中，冬凌草甲素通過誘導誘導內源性NO的生成，激活NO-ERKp53信號通路，從而介導肉瘤細胞的自噬，發揮抗腫瘤作用[24]。在本研究中，采用不同濃度的冬凌草甲素處理HL-60細胞后，細胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平均明顯升高，表明冬凌草甲素可促進HL-60細胞自噬的增加。

LncRNA是一類由RNA聚合酶Ⅱ轉錄的長度大于200個核苷酸的RNA分子，無明顯的開放閱讀框且幾乎無編碼蛋白功能。近年來，隨著高通量轉錄組測序等技術的發展，越來越多的LncRNA被確證為急性髓系白血病的診斷、預后分子靶標，其中，LncRNA-H19是研究熱點之一。王彩霞等[25]通過MTT染色法以及流式細胞術初期確定LncRNA-H19具有調控急性髓系白血病細胞增殖和凋亡功能。Zhao等[26]通 過 研 究 發 現，LncRNA-H19在 急 性髓系白血病患者骨髓中異常高表達，而LncRNAH19可通過競爭性結合has-miRNA-19a和hasmiRNA-19調控細胞中DNA結合抑制劑2表達而促進細胞增殖。在本研究中，HL-60細胞經不同濃度的冬凌草甲素處理后，細胞中的LncRNA-H19 mRNA表達均明顯明顯降低，說明冬凌草甲素對HL-60細胞中的LncRNA-H19表達具有抑制作用。再進一步采用siRNA技術沉默LncRNA-H19的表達后，HL-60細胞細胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著增加，Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達顯著上調，Bcl-2的表達顯著下調，提示LncRNA-H19低表達與冬凌草甲素具有協同抑制HL-60細胞增殖，促進HL-60細胞凋亡和自噬作用。

總而言之，本研究首次證實了冬凌草甲素通過抑制HL-60細胞中LncRNA-H19的表達而增加細胞中Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達，減少細胞中Bcl-2的表達，進而發揮抑制細胞增殖,促細胞凋亡、自噬作用。