402例壯族孕期女性GJB3、SLC26A4基因測序結果分析

覃衛娟 李玉蝶 黃嬌華

南寧市婦幼保健院檢驗科，廣西南寧 530011

聽力受損是最常見的出生缺陷，影響著全世界7千萬人口。根據國內外大量研究表明50%以上的聽力損失是遺傳因素導致[1]，遺傳性耳聾主要的遺傳模式是常染色體隱性遺傳，其次是常染色體顯性遺傳。隨著測序技術的應用，大量的常染色體顯性遺傳和隱性遺傳基因被發現與耳聾相關，GJB3在我國主要的突變位點是c.538C＞T，而SLC26A4基因突變位點主要是c.919-2A＞G[2]。SLC26A4基因突變是引起遺傳性耳聾Pendred綜合征（pendred syndrome，PDS）/非綜合征性前庭導水管擴大（nonsyndromic enlarged vestibular aqueduct，NSEVA）的重要基因。PDS/NSEVA是感覺神經性聽力損失（sensorineural hearing loss，SNHL）譜系，通常是先天性，聽力損傷從嚴重到極其嚴重，同時有前庭功能障礙或伴有顳骨異常，在兒童晚期至成年早期PDS會出現甲狀腺功能正常性甲狀腺腫的發展，而NSEVA則不包括[3]。SLC26A4基因突變是常染色體遺傳性耳聾的第二大遺傳因素，耳聾基因變體數據庫顯示超過400個與耳聾相關的SLC26A4基因致病性位點已經被報道[4]。SLC26A4基因突變具有高度的異質性，SLC26A4在我國主要的致病突變位點是c.919-2A＞G和c.2168A＞G，而在日本、韓國是c.2168A＞G突變[5]，不同的位點在各個區域和民族之間突變有顯著差異，為了篩查適合本地區的耳聾基因突變位點，了解本地區壯族孕期女性GJB3和SLC26A4基因突變攜帶情況，本研究對GJB3和SLC26A4基因進行測序，為產前篩查、產前診斷、新生兒耳聾基因篩查提供遺傳咨詢數據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6～12月來自南寧市婦幼保健院產前門診聽力正常的402例壯族孕期女性，在知情同意下抽取孕婦外周血提取DNA，對耳聾基因GJB3、SLC26A4進行全基因測序。本研究遵循醫學倫理要求，并取得了南寧市婦幼保健院醫學倫理委員會的同意。

1.2 檢測方法

使用測序法檢測402例孕婦GJB3和SLC26A4基因。（1）文庫構建：根據樣品量計算需配制的PCR擴增體系，選取目的片段擴增程序進行擴增；（2）文庫純化；（3）文庫質檢：參照KAPA Library Quantification KitIllumina? platforms TDS對文庫進行定量；（4）測序：將文庫pooling，變性最終以1.8pM的文庫上機測序。生物信息學分析：利用GATK工具判讀SNP和Indel位點；利用Snpeff工具注釋SNP，最后利用dbSNP、千人基因組數據庫、HGMD等數據庫、clinvar數據庫進行注釋和比較分析。

1.3 分類依據

根據耳聾基因變體數據庫（http://deafnessvariationdatabase.org/）對突變位點進行分類，分為良性、致病性、可能良性、重要性不明確、新發現位點。

2 結果

2.1 檢測結果

對402例壯族孕期女性進行耳聾基因GJB3和SLC26A4測序發現，163例攜帶有耳聾基因突變，其中GJB3 和SLC26A4分別為99例和64例，攜帶率較高為40.55%（163/402）。其中攜帶致病性突變位點21例，GJB3 和SLC26A4分別為2和19例，攜帶率為5.22%（21/402）。GJB3和SLC26A4復合突變21例。

2.2 GJB3測序結果

對402例壯族孕期女性進行GJB3耳聾基因測序，共發現99例孕期女性攜帶GJB3突變，突變攜帶率為24.63%（99/402），共9個突變位點，突變等位基因數104個；其中5個是良性突變位點，重要性不明確位點2個，致病性位點2個。本研究中GJB3常見的突變位點是c.357C＞T和c.53G＞A分別占104個總突變等位基因的74.04%和14.42%，均為良性突變；GJB3重要性不明確突變位點2個，分別為c.474G＞A位點2例，c.131G＞A位點1例；在我國c.538C＞T和 c.547G＞A位點為致病性位點，402例孕期女性中各檢出1例，均為雜合突變，GJB3致病位點攜帶率為0.50%（2/402）。見表1。

表1 402例孕期女性GJB3基因測序結果分析

2.3 SLC26A4測序結果

402例壯族孕期女性SLC26A4基因檢測出64例突變，攜帶率為15.92%（64/402），共33個突變位點,突變等位基因數73個。其中致病性位點共6個，共檢出突變19例，等位基因數19個分別為c.1983C＞A、c.1547dup、c.754T＞C、c.1905G＞A、c.919-2A＞G、c.678T＞C，致病性位點攜帶率為4.73%（19/402），占突變等位基因數26.03% （19/73）；檢出率前三位分別是c.1983C＞A位點5例，c.1547dup位點5例，c.754T＞C位點4例，分別占總突變等位基因的6.85%，6.85%，5.48%；而常見的突變位點c.919-2A＞G僅2例；本研究還檢出2個（2.74%）可能良性位點, 等位基因數2個（2.74%)：c.818C＞T、c.16G＞A；5個良性位點，等位基因數24個（32.88%）：c.69C＞A、c.2236-25T＞A、c.919-18T＞G、c.1707+76G＞C、c.1826T＞G；13個重要性不明確位點，等位基因數20個（27.40%）及7個新發現的突變位點，等位基因數8個（10.96%）。4類突變位點中致病性位點、良性突變位點和重要不明確位點所占比例接近，可能良性突變位點與新發現突變位點所占比例較少。33個突變位點中最常見的是c.69C＞A良性位點，等位基因數13個，占總突變等位基因數的17.81%，其他的突變等位基因位點所占比例均為6.85%及以下。見表2。

表2 402例孕期女性SLC26A4基因測序結果分析

2.4 GJB3和SLC26A4基因復合突變

402例壯族孕期女性中發現有21例攜帶GJB3和SLC26A4基因復合突變，攜帶率為5.22%。21例復合突變中共有18種基因型，攜帶有致病性位點的基因型有5例，分別為c.357C＞T/c.754T＞C、c.357C＞T/c.1905G＞A、c.357C＞T/c.1983C＞A，其他15種基因型未攜帶有致病性突變位點，但因是GJB3與SLC26A4復合突變，故其致病性未知。見表3。

表3 GJB3和SLC26A4基因復合突變結果分析

3 討論

GJB3基因編碼縫隙連接蛋白CX31，位于1p34號染色體上，有一個編碼外顯子，c.547G＞A和c.538C＞T位點位于該編碼區上。目前在人類耳聾基因變體數據庫記錄的GJB3介導的常染色體隱性遺傳非綜合征性耳聾上的突變位點僅8個，本研究中未檢出，c.547G＞A和c.538C＞T位點在該數據庫中分類屬于重要性不明確，本研究中分類為致病性位點。c.547G＞A和c.538C＞T位點突變早期被認為其可導致遺傳性高頻聽力損失[6]，然而這兩個位點的致病性一直存在爭議[7-8]，目前為止并沒有系統的耳聾基因系研究證明這兩個位點突變與耳聾的相關性，更有報道GJB3基因c.538C＞T位點突變與聽力損失無關[7]。早期在我國這兩個位點被認為是致病的，然而國內大量的研究報道不管是在健康人群還是在聽力障礙人群中GJB3基因c.538C＞T和c.547G＞A位點突變率均很低，在廣西也并非耳聾基因突變位點，壯族人群中的c.547G＞A和c.538C＞T突變攜帶率極低。本研究中402例壯族孕期女性共檢出9個突變位點，其中c.538C＞T和c.547G＞A位點突變各檢出1例，GJB3致聾性突變發病率很低，并非本地區壯族孕期女性的耳聾基因突變熱點。

SLC26A4基因編碼一個跨膜分子蛋白，該蛋白在氯化物、碘化物、碳酸氫鹽和甲酸鹽的轉運中發揮重要作用，SLC26A4致病性突變產物會導致該蛋白部分或完全失去活性從而引起Pendred綜合征/非綜合征性前庭導水管擴大（PDS/NSEVA）[3]。PDS/NSEVA以常染色體隱性遺傳方式遺傳，在SLC26A4雙等位基因致病性變異的家族受孕時受累個體的每個同胞兄弟姐妹受累的發生率為25%，成為無癥狀攜帶者的幾率為50%，未受累且不是攜帶者的發生率為25%[9]。當已知家族有SLC26A4致病性突變時，對高危家族成員進行攜帶者檢測、對高危妊娠進行產前篩查和植入前基因診斷是很有必要的。SLC26A4基因突變具有高度異質性，在我國主要是c.919-2A＞G突變為主，其次為c.2168A＞G[10]；而日本韓國主要是c.2168A＞G為主[5，11]；歐美白人主要以c.1246A＞C、c.412G＞T、c.707T＞c為主[12]。考慮到SLC26A4基因突變不同區域種族遺傳的異質性，本研究對402例壯族孕期女性進行SLC26A4全基因測序，旨在發現適合本地區的突變位點，增加本地區的突變譜。本研究結果提示，在402例壯族孕期女性中，SLC26A4基因常見的致病突變位點是c.1983C＞A位點5例，c.1547dup位點5例，c.754T＞C位點4例，c.1905G＞A位點2例，c.919-2A＞G位點2例和c.678T＞C位點1例，共6個位點19例，攜帶率為4.73%（19/402），而我國常見的突變位點c.919-2A＞G和c.2168A＞G在本地區并非突變位點。本研究中c.1983C＞A和c.1547dup位點已在我國的EVA患者中檢出[13-14]；c.754T＞C突變位點的致病性已在EVA患者列隊中有報道[10，15]，在我國新生兒攜帶率約0.14%[16]，本研究中檢出率為1.00%，可能是本研究樣本數有限；而檢出率較低的c.1905G＞A和c.678T＞C位點在我國的EVA患者中已有報道[13]。本研究通過對SLC26A4進行基因測序發現，廣西南寧市壯族孕期女性常見的突變位點為c.1983C＞A、c.1547dup、c.754T＞C、c.1905G＞A、c.919-2A＞G和c.678T＞C，與國內其他地區有顯著差異，可能是其他地區未檢測以上幾個位點，也可能是本研究例數有限。

本 研 究 共 檢 出21例GJB3與SLC26A4復合雜合突變，攜帶率為5.22%；其中有5例攜帶SLC26A4致病性突變位點，攜帶率為1.24%。兩個基因復合突變對耳聾的致病作用有待進一步研究，在健康孕期女性中篩查出此類復合突變建議進行遺傳咨詢。

綜上所述，南寧市壯族孕期女性攜帶GJB3突變較低，并非本地區壯族孕期女性的耳聾基因突變位點；南寧市壯族孕期女性SLC26A4突變較高，突變譜具有多樣性，常見致病突變位點為c.1983C＞A、c.1547dup、c.754T＞C、c.1905G＞A、c.919-2A＞G和c.678T＞C；壯族孕期女性GJB3與SLC26A4復合雜合突變對耳聾的致病作用有待進一步研究。因此對南寧市壯族孕期女性進行耳聾基因檢測時可增加篩查SLC26A4基因以上突變位點，指導優生優育。