再生基因4（RegⅣ）的原核表達、蛋白結構復性及純化

徐楊張學良杜惠芬柴丹丹連曉雯張瑞君李克生

1.甘肅省醫學科學研究院，甘肅 蘭州730050；2.甘肅省腫瘤醫院，甘肅 蘭州750050

再生基因4（regenerating geneⅣ，RegⅣ）為鈣依賴性凝集素（c型凝集素）超家族的一員，是一種小分子分泌性蛋白質，分子量約為18.2KD，由158個氨基酸構成，包括22個氨基酸的信號肽和一個C型植物凝集素識別結構域［1，2］。RegⅣ蛋白在消化道腫瘤、生殖系統及其他系統腫瘤以及潰瘍和炎性組織中呈高表達［3-5］，在正常胃腸道及胰腺中的表達水平非常低；其異常表達能夠顯著促進腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲和遷移，抵抗凋亡，并可提高腫瘤細胞對化療藥物和放射線的耐受水平［6，7］。本研究團隊前期對胃癌中RegⅣ和SOX9的調控關系進行了研究，發現Reg IV可能通過調控SOX9的表達水平參與胃癌細胞的侵襲和遷移［8］?？梢?，RegⅣ在腫瘤的發生、發展過程中起著重要作用。本研究在大腸埃希菌系統中構建攜帶目的基因的原核表達質粒，誘導表達人RegⅣ全長重組蛋白，并對表達的包涵體蛋白進行結構復性、純化，為制備RegⅣ單抗及開發新型的RegⅣ抗癌靶向治療藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）購自Merck公司；pET-30a表達載體為中國農業科學院蘭州獸醫研究所惠贈；DNA Marker，蛋白質Marker，限制性內切酶KpnⅠ和BamHⅠ，T4 DNA連接酶購自Takara公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），純化試劑盒，質粒提取試劑盒購自大連寶生物公司；本研究所用其他相關試劑均為國產分析純；pEGFP-C1-RegIV質粒由本實驗室前期試驗構建保存（酶切位點為KpnⅠ/BamHⅠ）。

1.2 構建pET-30a-RegIV重組質粒 將本實驗室前期構建保存的序列正……