冬小麥免耕覆蓋與生物有機肥施用對土壤細菌群落的影響

王小玲,馬 琨,伏云珍,安嫄嫄,汪志琴,

1 寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)國家重點實驗室培育基地,銀川 750021 2 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021 3 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085

免耕是指不翻耕和擾動土壤,把作物直接播種到種床上,將前茬作物殘茬或草皮等覆蓋地表,僅播種一次田間作業(yè)的農(nóng)作制度[1]。可以減少水土流失,穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)[2-3],形成合理的土壤水、氣、熱三相比；在改善土壤微生態(tài)環(huán)境,促進土壤養(yǎng)分良性循環(huán)中起主要貢獻[4]。

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,能夠參與土壤養(yǎng)分循環(huán),分解等過程,對溫室氣體產(chǎn)生和環(huán)境污染物凈化起著重要作用[5]。近年來,大量研究證實,土壤微生物的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)及多樣性是維持土壤健康和質(zhì)量的重要因素[6]。因此,研究不同耕作措施下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律,對選擇合理的種植措施和改善土壤生態(tài)功能具有重要意義。

目前關(guān)于不同農(nóng)業(yè)管理措施下,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化的研究結(jié)果仍存在差異[1,3]。如長期免耕或綠肥翻壓會增加土壤微生物數(shù)量,影響其多樣性[7]；保護性耕作施生物有機肥也能夠提高土壤細菌多樣性和生物量[8]。但,傳統(tǒng)耕作施化肥和有機肥卻對土壤細菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響較小[9]。Yang等[10]研究結(jié)果顯示,免耕和秸稈還田能夠增加土壤有機碳含量,調(diào)控土壤微生物生長及群落結(jié)構(gòu)多樣性,在提升土壤肥力和生產(chǎn)力方面有重要作用。

然而,以往研究更多關(guān)注的是耕作方式及施肥種類的差異對土壤生物生物量、酶活性和微生物呼吸作用等方面的影響,而同時采用免耕、覆蓋和生物有機肥施用等栽培管理措施對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)影響的研究鮮有報道。因此,本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù),對寧夏南部山區(qū)冬小麥連續(xù)3年免耕體系下土壤細菌群落群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性分布特征進行系統(tǒng)分析,探討不同處理措施下土壤細菌群落結(jié)構(gòu)差異,明確耕作、覆蓋與施肥方式的交互作用是如何影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性？為制定合理的農(nóng)作制度提供理論支撐。

1 研究區(qū)域和方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于寧夏固原市隆德縣沙塘鎮(zhèn)(35°21′ N,105°48′ E),如圖1所示：地處寧夏南部邊陲,六盤山脈以西,屬于黃土高原丘陵區(qū)。氣候類型為中溫帶季風(fēng)區(qū)半濕潤向半干旱過渡性氣候,年均氣溫6 ℃,年均降水量410 mm,年均蒸發(fā)量1370 mm。海拔1720—2942 m,地勢東高西低,土壤質(zhì)地主要以黑壚土為主。試驗前土壤基本理化性狀：有機質(zhì)10.63 g/kg,全氮0.52 g/kg,堿解氮41.0 mg/kg,全磷0.65 g/kg,速效磷45.5 mg/kg,速效鉀170.5 mg/kg,pH 9.0。

圖1 研究區(qū)地理位置Fig.1 Location of the research area

1.2 試驗設(shè)計

本試驗于2015年春季開始,采用雙因素隨機區(qū)組設(shè)計。A因素為耕作方式：分為免耕覆蓋(N)、傳統(tǒng)耕作不覆蓋(T)2個水平；B因素為施肥方式：分為施生物有機肥(F)和不施生物有機肥(C),共4個處理,即免耕覆蓋+施生物有機肥(NF)、免耕覆蓋+不施生物有機肥(NC)、傳統(tǒng)耕作不覆蓋+施生物有機肥(TF)和傳統(tǒng)耕作不覆蓋+不施生物有機肥(TC),每個處理4次重復(fù),小區(qū)面積3 m×4 m,共16個小區(qū)。于2015年—2018年9月種植冬麥(Triticumaestivum)‘藍天32號’。前茬作物為蠶豆(ViciafabaL)‘臨蠶6號’。2015年冬小麥種植前將蠶豆秸稈粉碎與3000 kg/hm2脫粒的小麥穎殼均勻覆蓋于免耕處理土壤表面,后續(xù)試驗不再覆蓋任何材料。冬小麥播種量為375 kg/hm2,每小區(qū)播種12行。施肥處理的小區(qū)僅施生物有機肥(黃腐酸≥12%,有機質(zhì)≥40%,巨大芽孢桿菌+膠凍樣類芽孢桿菌≥0.5億/g,凈含量40 kg/袋),施用量折合純氮(N%)90 kg/hm2,純磷(P2O5%)為19.67 kg/hm2、純鉀(K2O%)為18.58 kg/hm2。NF處理的小區(qū),生物有機肥隨冬小麥種子條施于播種溝內(nèi),TF處理隨播前耕翻施入土壤。在返青期,將前者的田間雜草齊地表割掉,覆蓋在冬小麥行間；后者雜草連根拔除,扔出田外。

1.3 樣品采集

2018年7月在試驗區(qū)采樣,按照“S”形隨機多點混合取樣,采集耕層0—20 cm土壤樣品,每個小區(qū)隨機采集5個樣點混勻為1份,共獲得16份樣品。樣品采集后去除新鮮土樣中可見植物殘體及土壤動物,按四分法取1 kg土樣放入采樣袋中,冰盒帶回實驗室。一部分自然風(fēng)干后用于測定土壤養(yǎng)分；另一部分保存在-80冰箱,用于土壤細菌多樣性測定。

1.4 試驗方法

1.4.1土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水量采用烘干法,土壤pH值采用PHSJ-4F pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測定(土水比1:5)；土壤全碳(TC)和總氮(TN)采用碳氮分析儀(Elementar Vario MAX)測定；土壤微生物生物量碳(SMBC)采用氯仿熏蒸—0.5 mol/L K2SO4提取；土壤全磷(TP)和速效磷(AP)采用鉬銻抗比色法；堿解氮(AN)采用堿解擴散法；速效鉀(AK)采用NH4OAc浸提-火焰光度法[11]。

1.4.2DNA提取和高通量測序

采用Fast DNA SPIN kits試劑盒(MP Biomedicals,USA),按照說明書進行土壤微生物總DNA提取,提取后使用Nanodrop 2000進行DNA濃度和純度的測定,并用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。最后利用細菌16S rDNA基因的V3+V4區(qū)域進行擴增,引物序列為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。采用50 μl擴增體系,反應(yīng)程序為：98 ℃ 預(yù)變性2 min,98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃ 延長30 s,72 ℃終延伸5 min,10 ℃持續(xù)25—30個循環(huán)。PCR結(jié)束后,引入Illumina MiSeq 橋式PCR兼容引物進行第二輪擴增,使用PicoGreen dsDNA Kit 分析試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)對回收的DNA精確定量[12],最后將PCR產(chǎn)物委托上海派森諾生物科技股份有限公司進行Illumina MiSeq 測序。

1.4.3統(tǒng)計分析

高通量測序數(shù)據(jù)利用QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, v1.8.)和R(v3.2.0)軟件,調(diào)用USEARCH序列比對工具,對優(yōu)質(zhì)序列按97%相似度水平的OTUs(Operational Taxonomic Units)進行分類學(xué)分析。采用Mothur軟件對全部有效序列進行OTU聚類統(tǒng)計,繪制韋恩圖(Venn圖)。根據(jù)物種分類信息繪制物種豐度熱圖。利用Mothur軟件[13-14]計算多樣性指數(shù)(Simpson、Shannon、Chao1和ACE)。通過UniFrac軟件進行NMDS分析,繪制樣本聚類樹[15]。采用DPS(7.05)軟件對土壤理化性質(zhì)、作物產(chǎn)量等數(shù)據(jù)進行方差分析(Duncan′s法多重比較法,顯著水平設(shè)為0.05)。土壤微生物主成分分析(PCA)在多元統(tǒng)計分析軟件Canoco 5.0中進行。Origin 8.0繪制降雨量點線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

不同處理土壤理化性質(zhì)如表1所示。土壤含水量、速效鉀、堿解氮、總碳和總氮含量整體表現(xiàn)為免耕覆蓋處理明顯高于傳統(tǒng)耕作處理,而土壤pH、C/N比則表現(xiàn)為傳統(tǒng)耕作處理顯著高于免耕處理。方差統(tǒng)計分析顯示,與不施用生物有機肥處理相比,施用生物有機肥影響了不同處理間的土壤理化性質(zhì),但差異不顯著；而耕作措施卻顯著改變了不同處理間土壤pH、C/N比、全氮含量(F=6.565,P=0.031*；F= 49.391,P=0.0001**；F=19.871,P=0.002**)。同時,不施用生物有機肥時,土壤pH、AP、C/N 比和SMBC 表現(xiàn)為TC>NC,其余土壤理化性狀在各處理間均呈現(xiàn)NC>TC,其中SMBC和TN含量分別增加了94.04%和15.38%。施用生物有機肥時,SMBC、AP、AN、TC和TN含量均呈現(xiàn)NF>TF；尤以SMBC和AP含量增加幅度最大,分別為114.74%和21.87%；而C/N比和AK的含量與之相反,分別降低了5.60%和7.04%。

表1 不同處理土壤理化及生物學(xué)性狀分析Table 1 Analysis of physical and chemical and biological characteristics of soil under different treatments

2.2 細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及測序數(shù)據(jù)分析

通過對土壤DNA基因組序列分析發(fā)現(xiàn)(表2),4種處理總共獲得785688條有效序列,其中TC、TF、NC和NF處理分別獲得細菌16S rRNA的平均序列數(shù)48607、48101、52687、47028條。對測序獲得的序列采取隨機抽樣方法,并基于每個深度下抽取到的序列數(shù)及對應(yīng)的OTU數(shù)繪制Specaccum物種累積曲線(圖2),結(jié)果表明,土壤樣品的Specaccum物種累積曲線在樣本數(shù)大于10時漸漸趨于平緩,說明不同處理土壤所測的序列庫容能夠較好反映土壤細菌群落的物種數(shù)量,故測序數(shù)據(jù)基本合理。

圖2 物種累積曲線圖Fig.2 Species accumulation curve of different soil samples

表2 土壤細菌測序數(shù)據(jù)及多樣性指數(shù)分析Table 2 Sequencing data and diversity index analysis of soil bacteria

2.3 細菌OTU統(tǒng)計及多樣性分析

Venn圖能夠直觀反映不同處理間土壤細菌群落OTUs 組成的差異性及重疊關(guān)系[16]。由圖3可知,OTU水平上,TC、TF、NC和NF 4個處理中的OTU數(shù)分別為6252、5827、5867個和5936個,其中共有OTU數(shù)為3166個,特異性O(shè)TU數(shù)分別為802、568、573個和621個,表現(xiàn)為TC>TF>NC>和TF,且共有OTU數(shù)(3166) 是4種處理中特異性細菌OTU數(shù)的4—6倍。此外,各處理特異性O(shè)TU數(shù)以TC最大,NF次之；相比NC處理,NF中的OTU數(shù)呈現(xiàn)增加趨勢；相比TC,TF中OTU數(shù)呈降低趨勢,這說明傳統(tǒng)耕作不覆蓋施用生物有機肥處理(TF)對土壤細菌群落OTU可能會產(chǎn)生抑制作用,而免耕覆蓋施生物有機肥處理(NF)在一定程度上則起到促進作用。

圖3 OTUs分布的維恩圖 Fig.3 OTUs Venn distribution diagram of soil bacterial communities TF: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋施生物有機肥Conventional tillage without mulching, and bioorganic fertilizer; TC：傳統(tǒng)耕作不覆蓋不施生物有機肥Conventional tillage without mulching, and no bioorganic fertilizer; NF: 免耕覆蓋施生物有機肥No-tillage, mulching and bioorganic fertilizer; NC: 免耕覆蓋不施生物有機肥No-tillage, mulching no bioorganic fertilizer

通過分析土壤樣品,計算得到土壤細菌Alpha多樣性指數(shù)(表2)。結(jié)果顯示,不同處理下ACE指數(shù)為4092.07—4579.71,Chao1指數(shù)為3627.36—4209.83,香濃指數(shù)為10.42—10.55,辛普森指數(shù)為0.997—0.998。當耕作覆蓋和施用生物有機肥兩因素交互作用時,土壤細菌豐富度指數(shù)(ACE和Chao指數(shù))表現(xiàn)為TC>NF>NC>TF；而多樣性指數(shù)(Simpson和Shannon指數(shù))卻呈相反趨勢,表現(xiàn)為：NF>NC>TC>TF。與TF處理相比,NF處理中,shannon指數(shù)和Chao指數(shù)分別增加了12.5%和7.95%。而Simpson 指數(shù)降低了2.73%。整體上,傳統(tǒng)耕作在一定程度上增加了土壤細菌群落的多樣性指數(shù),降低了豐富度指數(shù)。

2.4 細菌門水平相對豐度

通過對高通量測序結(jié)果進行分析,從4個處理中獲得土壤細菌菌群分屬于27門、86綱、125目、213科和315屬。在門水平上,共獲得34個類群(包括未鑒定類群和其他)。將相對豐度< 1%的類群歸為其他,得到20個類群(圖4)。其中放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteri)為優(yōu)勢菌門(相對豐度≥1%),其相對豐度分別為26.90%、26.20%、15.80%和13.50%。而芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospira)、浮霉菌門(Planctomycetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等是非優(yōu)勢菌門(相對豐度≤1%)。由圖4可知,耕作和施肥兩因素均對土壤細菌門水平相對豐度產(chǎn)生了影響,其中綠彎菌門和酸桿菌門的相對豐度在不施用生物有機肥處理中均表現(xiàn)為NC>TC；而施用生物有機肥時,綠彎菌門的相對豐度呈現(xiàn)NF

圖4 門水平上土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig.4 The composition of soil bacterial community at phylum level

通過熱圖的顏色變化梯度和相似性能夠驗證物種群落組成的差異性和相似性。從土壤細菌的前50個屬的熱圖分析發(fā)現(xiàn)(圖5)。4種處理中的細菌群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著變化。其中TF處理中,綠彎菌門的玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)的相對豐度較高；NF處理下放線菌門中的類諾卡氏菌屬(Nocardioides)和土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)為優(yōu)勢菌屬；TC處理的變形菌門中(Proteobacteria)的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Nordella屬、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium),酸桿菌門中的芽孢桿菌屬(Blastocatella)具有較其他處理更高的豐度分布特征；NC處理中Haliangium屬和擬孢囊菌屬(Kibdelosporangium)占據(jù)較高豐度。此外,TF和NF、TC和NC聚為一類,說明在免耕和施用生物有機肥的交互作用下,主要以是否施用生物有機肥為主導(dǎo)因素。

圖5 各處理土壤優(yōu)勢細菌在屬水平的群落熱圖分析Fig.5 Heat map analysis of the main bacteria at the genus level in each treatment soilAcidobacteria: 酸桿菌門;Actinobacteria： 放線菌門; Gemmatimonadetes: 芽單胞菌門; Chloroflexi: 綠彎菌門; Proteobacteria: 變形菌門; Nordella屬; 鞘氨醇單胞菌: Sphingomonas; 慢生根瘤菌: Bradyrhizobium; 芽孢桿菌屬: Blastocatella; 硝化螺菌屬: Nitrospira; H16; Bryobacter; Acidibacter屬; 芽單胞菌屬: Gemmatimonas; RB41; Aeromicroiumshu屬; Stenotrophobacter; Variibacter; CL500-29_marine; OM27_clade; 紅游動菌屬: Rhodoplanes; Ilumatobacter屬; Gaiella屬; Actinophytocola屬; 未鑒定的放線菌屬: Actinobacteria_unidentified; 紅色桿菌屬: Rubrobacter; 玫瑰彎菌屬: Roseiflexus; 假節(jié)桿菌屬: Pseudarthrobacter; 土微菌屬: Pedomicrobium; Kibdelosporangium; Haliangium; 韓國生工菌屬: Kribbella; 未鑒定的酸桿菌屬: Acidobacteria_unidentified; 指孢囊菌屬: Dactylosporangium; 倫茨氏菌屬: Lentzea; 游動放線菌屬: Actinoplanes; Virgisporangium; 壤霉菌屬: Agromyces; 芽球菌屬: Blastococcus; 地嗜皮菌屬: Geodermatophilus; Skermanella; Candidatus_Alysiosphaera屬; 假諾卡氏菌屬: Pseudonocar Haliangiumdia; 鏈霉菌屬: Streptomyces; 小單孢菌屬: Micromonospora; 分枝桿菌屬: Mycobacterium; Iamia 屬; Parviterribacter; 土壤紅桿菌屬: Solirubrobacter; 類諾卡氏菌屬: Nocardioides; Devosia; Microvirga屬; 纖維菌屬: Cellulomonas

2.4.1細菌門水平相對豐度差異性分析

不同處理中土壤細菌群落在門水平上的相對豐度差異性分析結(jié)果表明(圖6)。土壤細菌中的酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)和螺旋體菌門(Saccharibacteria)的相對豐度在TF與NC處理間有顯著差異(P=0.046、P=0.018、P=0.013和P=0.016)；放線菌門(Actinobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度在NF與NC處理間也有顯著差異(P=0.042、P=0.023、P=0.032和P=0.040)。當耕作和施用生物有機肥兩因子交互時,硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對豐度在TF和NF中均達到顯著水平(P=0.0212)；而變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度在TF與TC處理間有顯著差異(P=0.026)。此外,芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在NF與NC之間也達到極顯著水平(P=0.005)。由此說明,施用生物有機肥會顯著影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上差異。

圖6 不同處理土壤細菌群落組成在門水平的差異分析Fig.6 The differential analysis of soil bacterial community of soil samples of the different treatments based on the phylum level

2.4.2不同處理下土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

基于R軟件,采用非度量多維尺度分析(NMDS,Nonmetric multidimensional scale analysis)來反映土壤細菌群落的β多樣性(Stress=0.106)。如圖7顯示,不同處理對土壤細菌群落β多樣性產(chǎn)生了明顯影響,且形成了不同的群落空間分布結(jié)構(gòu)。在不施用生物有機肥處理時,TC和NC處理的細菌群落在空間分布上相對較集中；但當施入生物有機肥后,TC和TF、NC和NF處理卻出現(xiàn)明顯分離,差異較大。

圖7 不同處理土壤細菌非度量多維尺度分析(NMDS)分布 Fig.7 The distribution of soil bacteria in different treatments was analyzed on a nonmetric multidimensional scaleTF: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋施生物有機肥Conventional tillage without mulching, and bioorganic fertilizer; TC：傳統(tǒng)耕作不覆蓋不施生物有機肥Conventional tillage without mulching, and no bioorganic fertilizer; NF: 免耕覆蓋施生物有機肥No-tillage, mulching and bioorganic fertilizer; NC: 免耕覆蓋不施生物有機肥No-tillage, mulching no bioorganic fertilizer

利用主成分分析發(fā)現(xiàn)(圖8a),土壤細菌的豐富度指數(shù)(ACE和Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Simpson和Shannon指數(shù))與土壤pH、速效磷和C/N比成正相關(guān),與土壤全氮、堿解氮、含水量、有機碳和微生物生物量碳成負相關(guān)。對細菌群落分布的共同解釋為88.57%。其中在門水平分類學(xué)組成中,放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對豐度均與土壤含水量、堿解氮、有機碳、微生物生物量碳成正相關(guān),與土壤pH、速效鉀呈負相關(guān)(圖8b)；擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度與土壤速效鉀和全磷成正相關(guān),與微生物生物量碳、C/N比和有機碳含量均呈負相關(guān)。芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)與土壤速效鉀、C/N比呈正相關(guān)；其中非優(yōu)勢門浮霉菌門(Planctomycetes)與土壤C/N、pH和堿解氮成正相關(guān),與土壤速效鉀、含水量成負相關(guān)。主成分1和主成分2分別占85.68%和9.37%,兩個排序軸累計變量能在95.05%上解釋細菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異性。另外,細菌門水平分類學(xué)組成與第一、二排序軸之間的相關(guān)性較高,其中pH和土壤微生物生物量碳(SMBC)分別是酸桿菌門和放線菌門的主要驅(qū)動因子。

圖8 細菌多樣性指數(shù)及門水平類群分布與土壤理化性狀間的多元分析(PCA)Fig.8 Multivariate analysis of bacterial diversity index, the distributionof soil bacterial communities based on the phylum level between soil physical and chemical characteristicsActino: Actinobacteria 放線菌門；Proteo: Proteobacteria 變形菌門；Chloro: Chloroflexi 綠彎菌門；Acido: Acidobacteria 酸桿菌門；Gemm: Gemmatimonadetes 芽單胞菌門；Nitro: Nitrospirae 硝化螺旋菌門；Plancto: Planctomycetes 浮霉菌門；Bactero: Bacteroidetes 擬桿菌門；pH、TN、TP、AP、AN、AK和TOC、SWC、C/N ration、SMBC分別指土壤pH、全氮、全磷、速效磷、堿解氮、速效鉀和有機碳、土壤含水量、碳氮比、土壤微生物生物量碳；Chao1、ACE、Shannon、Simpson分別指Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、香濃指數(shù)和辛普森指數(shù);圖中各形狀代表不同處理;NC(1—4)表示免耕、覆蓋和不施生物有機肥的4個重復(fù); NF(1—4)表示免耕、覆蓋和施生物有機肥的4個重復(fù);TC(1—4)表示傳統(tǒng)耕作、不覆蓋和不施肥的四個重復(fù);TF(1—4)表示傳統(tǒng)耕作不覆蓋和施生物有機肥的四個重復(fù)

2.5 不同處理對冬小麥產(chǎn)量的影響

由表3可知,冬小麥的產(chǎn)量在4種處理中均有明顯差異。2016年表現(xiàn)為NF>TF>TC>NC。在傳統(tǒng)耕作不覆蓋和免耕覆蓋兩種處理中,以施用生物有機肥處理最明顯。其中NF處理冬小麥產(chǎn)量最高達到3031.25 kg/hm2。而2017和2018年,傳統(tǒng)耕作措施下,相比不施用生物有機肥處理,施用生物有機肥處理顯著增加了冬小麥產(chǎn)量(P<0.05),以2018年冬小麥產(chǎn)量增加最顯著,達到22.25%。在綜合因素影響下,尤以傳統(tǒng)耕作施用生物有機肥處理效果最佳。隨種植時間延長,無論是否施用生物有機肥,免耕覆蓋處理下冬小麥產(chǎn)量均呈降低趨勢,而傳統(tǒng)耕作處理卻呈增加趨勢。分析認為這可能與當年氣候條件、耕作措施和施肥因子等綜合因素有關(guān)。

表3 不同處理對冬小麥產(chǎn)量的影響Table 3 The Effects of different treatments on yield of winter wheat

為進一步分析冬小麥產(chǎn)量與土壤細菌優(yōu)勢菌群的關(guān)系,將細菌前8門優(yōu)勢菌群與冬小麥產(chǎn)量作相關(guān)分析,結(jié)果表明(表4)：冬小麥產(chǎn)量與土壤細菌群落相對豐度均無相關(guān)性；而土壤硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)與酸桿菌門(Acidobacteria)顯著正相關(guān)(P<0.05)；放線菌門(Actinobacteria)與土壤酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)均呈極顯著負相關(guān)；變形菌門(Proteobacteria)與綠彎菌門(Chloroflexi)也呈極顯著負相關(guān)(P<0.01),說明土壤微生物功能群落之間存在更多的競爭關(guān)系。

表4 作物產(chǎn)量與土壤細菌豐度Pearson相關(guān)性Table 4 Pearson correlation between crop yield and soil bacterial abundance

3 討論

3.1 不同處理對土壤理化性質(zhì)及冬小麥產(chǎn)量的影響

有研究證實,土地利用方式不同,會造成土壤理化性質(zhì)出現(xiàn)差異[17]。本研究中,持續(xù)冬小麥免耕、覆蓋和施用生物有機肥均能顯著增加土壤養(yǎng)分含量,降低土壤pH,提升土壤全氮、總碳含量,這與Duineveld等[18]研究結(jié)果一致。與TC和NC處理相比,TF和NF處理均顯著增加了土壤總碳和全氮含量,分析認為生物有機肥是一種腐熟的肥料,施入后能為土壤微生物提供大量的碳源[19]。且在不覆蓋、不施生物有機肥處理的土壤中,作物根茬是有機質(zhì)的主要來源,同時,施入生物有機肥后,因外源有機物的輸入,也會導(dǎo)致土壤有機質(zhì)積累[20]。另一方面,當免耕、覆蓋與施用生物有機肥交互作用時,不但有小麥穎殼、田間生草覆蓋分解后的有機物質(zhì),還有生物有機肥中的營養(yǎng)元素進入土壤,為作物提供養(yǎng)分需求。因此,在一定程度上,土壤微生物對根茬的降解速度發(fā)生改變,提高了作物根茬的殘留量[21],減少了土壤有機質(zhì)的氧化和礦化速度,最終提高了土壤中總碳的含量[22]。

免耕覆蓋作為保護性耕作技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)措施之一,對培肥土壤、提高土壤水分利用率,保證旱區(qū)作物高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。有學(xué)者[23]指出,免耕和秸稈還田等保護性措施在一定程度上會影響小麥、水稻幼苗生長,降低作物產(chǎn)量。本研究中,第一年,冬小麥經(jīng)濟產(chǎn)量以NF處理最高,且隨種植年限的增加,相比傳統(tǒng)耕作,免耕處理產(chǎn)量出現(xiàn)大幅減產(chǎn)現(xiàn)象,尤其是2017年,差異最顯著。根據(jù)當?shù)貧庀筚Y料顯示(圖9),2015年—2017年,研究區(qū)8—12月的總降雨量分別為191.6、128.7、252.5 mm,可判定作物播種后,2016年低降雨量導(dǎo)致苗期持續(xù)干旱,可能是影響2017年冬小麥產(chǎn)量降低的根本原因。另外,本研究中,相比傳統(tǒng)耕作,免耕處理土壤容重上、中、下層均增加,其中以10—15 cm耕層土壤容重增加最顯著,可能是引起土壤板結(jié),造成水肥氣熱條件不協(xié)調(diào),最終影響作物產(chǎn)量的另一因素。這與王峻等[24]的研究結(jié)果一致。此外,研究中,相比不施生物有機肥處理,兩種施肥處理(NF和TF)中,2016—2018年冬小麥的產(chǎn)量均高于不施生物有機肥處理,這說明,施用生物有機肥,具有增產(chǎn)作用,其機制主要是生物有機肥中含有的芽孢桿菌,適于生活在各種環(huán)境中,耐受性和穩(wěn)定性極強,能夠促進土壤無效硅磷鉀的轉(zhuǎn)化,增加土壤硅磷鉀的供給,提高作物產(chǎn)量的能力導(dǎo)致[25],其深層原因還有待進一步探究。

圖9 2015—2018年研究區(qū)降雨量分布情況 Fig.9 Preipitationl distribution in the study area from 2015 to 2018

3.2 不同處理對土壤細菌Alpha多樣性的影響

土壤微生物作為評價土壤的重要生物學(xué)指標,因不同的農(nóng)業(yè)管理措施,其群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,也會影響農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換[22]。如李雨澤等[26]研究發(fā)現(xiàn),地膜覆蓋土壤細菌豐富度降低,秸稈還田細菌多樣性增加,而施用生物有機肥土壤細菌的多樣性也隨之增加[27]。本研究中,4種處理方式對土壤細菌群落多樣性指數(shù)(Simpson指數(shù))和豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù))均產(chǎn)生了不同程度的影響。TF處理土壤細菌豐富度指數(shù)(ACE指數(shù))提高,多樣性降低,而NF處理卻相反。分析認為這與傳統(tǒng)耕作措施,土壤頻繁擾動促進土壤碳源和氮源的轉(zhuǎn)化有關(guān)[28]。

土壤微生物多樣性往往受植被類型、作物種類、土壤質(zhì)地、pH、水分和通氣等因素的影響[29]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),土壤pH和有機碳是影響不同混交林中土壤細菌多樣性的主要環(huán)境因子；全氮和含水量是影響沙地土壤細菌結(jié)構(gòu)和多樣性的主導(dǎo)因子[30]。大量研究指出,土壤微生物在某種程度上,對干旱的響應(yīng)較大,一定強度的干旱會提高土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性,適宜的土壤水分條件則能為細菌生長繁殖創(chuàng)造良好條件,維持細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性[31-32]。這與本研究中土壤含水量與細菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)成負相關(guān)性的結(jié)果相似。此外,土壤pH 的變化也是引起不同管理制度中土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化的另一主要貢獻因子[32]。

3.3 不同處理對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響

Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)的發(fā)展為微生物的研究提供了一個強大高效的平臺,能夠快速有效地分析土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成[33]。有學(xué)者[34]認為,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的整體組成在不同生境中的差異可能較大,但優(yōu)勢菌群基本相似。在本研究中,4種處理下土壤細菌優(yōu)勢菌門均為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門,相對豐度之和超過80%,但各處理中的相對豐度各有差異,這與以往的一些研究相似[35-36]。與傳統(tǒng)耕作處理相比,免耕覆蓋處理下,土壤酸桿菌門、放線菌門和變形菌門的相對豐度提高了30.17%—35.11%,這主要是是由于殘茬及生草覆蓋后,為微生物提生命活動提供了有機碳源,刺激了土壤微生物的活性,加快了自身的物質(zhì)合成,使其豐度明顯增加[37]。其中,酸桿菌門在NF處理中相對豐度最高,這可能是免耕、殘茬及生草覆蓋后,植物根系分泌物導(dǎo)致土壤pH值下降[38](表1),促進了酸桿菌門的活動。也可能是施用的生物有機肥中含有的“巨大芽孢桿菌+膠凍樣類芽孢桿菌”,屬于芽孢桿菌屬,是一類硅酸鹽陽性細菌,能為土壤補入大量的有益微生物,在作物根部形成有益菌群,抑制土壤有害及致病微生物的繁殖等,在一定程度上,可能為土壤中優(yōu)勢菌群的繁殖創(chuàng)造了有利條件[39]。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn)具有降解土壤污染物功能的芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和將土壤中的亞硝酸氧化為硝酸鹽的硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對豐度在施入生物有機肥后分別降低了5.5%—8.6%和1.1%—2.6%,說明生物有機肥可能會抑制土壤污染物降解和氮肥力的提高[40]。另外,與其他3種處理相比,變形菌門中(Proteobacteria)能夠利用苯甲酸、水楊酸等物質(zhì)作為唯一碳源,降解土壤有毒物質(zhì),具有抵抗植物病原菌作用,適合生長在高度貧營養(yǎng)環(huán)境中的[41]鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在傳統(tǒng)耕作不施生物有機肥(TC)處理中相對豐度最高。

有學(xué)者研究證實,驅(qū)動土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生改變的主要因子是土壤全氮含量[42]。如酸桿菌門能夠降解植物殘體、參與單碳因子代謝；放線菌門參與土壤碳氮循環(huán)。而在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)土壤放線菌門與土壤堿解氮、全氮及土壤含水量呈正相關(guān),且土壤含水量是影響放線菌門的主導(dǎo)因子。這可能與土壤細菌自身屬性相關(guān)。普遍認為,變形菌門喜養(yǎng)分含量高的土壤；酸桿菌門喜貧瘠的土壤；而放線菌門主要存在于極度干旱的環(huán)境中[43]。綜上所述,不同環(huán)境因素對微生物類群的影響不同。因此,關(guān)于免耕覆蓋、施用生物有機肥等交互效應(yīng)改善土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成的內(nèi)在機制尚需進一步研究。

4 結(jié)論

免耕覆蓋、生物有機肥施用對土壤理化性質(zhì)均產(chǎn)生了一定影響,顯著增加了土壤總有機碳、總氮的含量，降低了土壤pH、C/N比和冬小麥的經(jīng)濟產(chǎn)量。與傳統(tǒng)耕作相比,免耕覆蓋施用生物有機肥提高了土壤細菌Simpson多樣性指數(shù),降低了Chao1豐富度指數(shù),且耕作和施用生物有機肥兩種因素均對土壤細菌群落分布產(chǎn)生了影響,其中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門為優(yōu)勢菌群。速效鉀和C/N比則是影響細菌群落組成中變形菌門和酸桿菌門相對豐度的主要驅(qū)動因子。