鹽脅迫對槲樹(Quercus dentata)幼苗離子平衡及其生理生化特性的影響

郝 漢,曹 磊,陳偉楠,胡增輝,冷平生,*

1 北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院,北京農(nóng)學(xué)院林木分子設(shè)計育種高精尖創(chuàng)新中心, 北京 102206 2 北京三元綠化工程有限公司, 北京 100026 3 中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所, 北京 100091

槲樹(QuercusdentataThunb.)是北京地區(qū)的重要鄉(xiāng)土樹種之一,具有涵養(yǎng)水源,保持水土的作用。槲樹樹冠廣展,秋葉呈橙紅色,葉大且形狀奇特,園林造景價值高。北京地區(qū)槲樹資源豐富,主要分布在北京西部和北部山區(qū)弱酸性土壤環(huán)境中,而在北京城市園林綠化中卻極為少見,這可能與平原地區(qū)土壤偏鹽堿性相關(guān)。北京園林綠化局將槲樹列為城市森林建設(shè)的骨干鄉(xiāng)土樹種,因此,了解槲樹的耐鹽性是十分必要的。

櫟類樹種的生態(tài)適應(yīng)性較強,在干旱及土壤瘠薄立地條件下均能良好生長。近些年已有學(xué)者對櫟樹的耐鹽性展開研究,如：李向應(yīng)等比較了鹽脅迫對北京槲櫟(Q.alienaBl. var.pekingensisSchott.)和銳齒槲櫟(Q.alienaBl. var.acuteserrataMaxim. ex Wenz.)離子分布及生理特性影響,北京槲櫟耐鹽性優(yōu)于銳齒槲櫟,更適宜北京地區(qū)的園林綠化[1]。從根系發(fā)育及離子運輸方面分析了麻櫟(Q.acutissimaCarruth.)和弗吉尼亞櫟(Q.virginianaMill.)2樹種的耐鹽性,弗吉尼亞櫟具有較強耐鹽性,麻櫟則為鹽敏感型植物[2]。李志萍等研究了栓皮櫟(Q.variabilisBl.)在NaCl脅迫下的生理響應(yīng),指出栓皮櫟能夠耐受0.6%濃度的鹽脅迫[3]。不同櫟樹的耐鹽性存在差異,但對其耐鹽機制仍了解不多。來自其他植物材料的大量研究表明,鹽脅迫下植物體內(nèi)離子和生理生化指標的變化與其耐鹽能力高度相關(guān)。黃連木(PistaciachinensisBunge.)在高濃度NaCl脅迫下產(chǎn)生離子毒害,細胞膜透性增大,引起細胞代謝失調(diào)[4]。衛(wèi)矛(Euonymusalatus(Thunb.) Sieb.)、沙棗(ElaeagnusangustifoliaLinn.)和美國白蠟(FraxinusamericanaLinn.)在鹽脅迫下根莖葉中Na+含量升高,K+含量變化卻呈現(xiàn)不同規(guī)律[5]。NaCl處理下冰葉日中花(MesembryanthemumcrystallinumL.)迅速積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)并提高抗氧化酶活性,以適應(yīng)鹽脅迫[6]。高濃度鹽脅迫使紅麻(ApocynumvenetumL.)、五葉地錦(Parthenocissusquinquefolia(L.) Planch.)葉片中可溶性糖、脯氨酸顯著積累[7-8]。鹽脅迫下對青錢柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.)生長和根系離子變化研究表明,其耐鹽閾值在1 g/L-1左右[9]。曹磊等研究了鹽脅迫條件下槲樹的光合響應(yīng)及葉綠素熒光變化,表明槲樹幼苗對鹽堿脅迫具有較強的抗性[10]。而槲樹在鹽脅迫下的離子平衡情況以及生理生化響應(yīng)仍不清楚。本研究擬對槲樹幼苗進行鹽脅迫試驗,分析其生理生化特性與離子濃度的變化,為進一步揭示槲樹的耐鹽性提供數(shù)據(jù)支撐,以期為槲樹應(yīng)用于北京城市地區(qū)甚至華北平原園林綠化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將采集于北京平谷玻璃臺林場的槲樹種子,在溫室砂藏催芽后,于2016年11月27日播種于規(guī)格為盆高20 cm,直徑22 cm的塑料花盆中,基質(zhì)配比為草炭:沙子:雞糞=5:3:1,實驗用盆下置托盤,定期除草、澆水、施肥,保證槲樹苗長勢良好。

1.2 鹽脅迫處理

2017年9月,選擇長勢一致的槲樹幼苗進行鹽脅迫實驗。分別用100、200、300 mmol/L的NaCl進行澆灌處理,每10天向盆中澆灌用去離子水配制的鹽溶液500 mL(對照加等量去離子水),保證溶液完全加入且不溢出托盤,每天對實驗苗進行稱重補水,補水時先沖洗托盤上的鹽粒,將洗液倒入盆中,避免鹽分流失,以保持盆內(nèi)鹽濃度一致。實驗持續(xù)30 d,300 mmol/L濃度NaCl脅迫第20天和200 mmol/L鹽脅迫第30天,槲樹葉片分別出現(xiàn)皺縮。300 mmol/L鹽脅迫第30天,葉片皺縮進一步加重,葉緣焦黃,并出現(xiàn)大量黃褐斑,部分植株致死。鹽脅迫第10、20、30天分別采集槲樹幼苗大小適中的功能葉進行生理生化指標的測定。將整株槲樹幼苗根、莖、葉分別烘干,進行離子含量測定。

1.3 指標測定及方法

根據(jù)葉樣鮮重和干重測定葉片含水量[11],用電導(dǎo)儀法測定葉片電導(dǎo)率[12],丙二醛含量用硫代巴比妥酸法測定[11],可溶性糖含量用蒽酮法測定[11],游離脯氨酸含量用茚三酮顯色法測定[11],過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性的測定分別采用愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法和氮藍四唑染色法[13],離子含量用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測定(Thermo Fisher公司,ICP-AES6300型)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用 Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖, 用 SPSS軟件進行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對槲樹根莖葉離子含量的影響

總體上,隨著NaCl處理濃度增加以及處理時間的延長,槲樹根和葉中Na+隨之升高,莖中含量則先升后降(圖1)。Na+含量的變化幅度與脅迫濃度呈正相關(guān),在高濃度脅迫第30天時,根系中Na+濃度為對照的3.5倍,莖與葉片中均為對照3倍。根莖葉中Na+含量對比可知,Na+在根系中的含量遠高于莖和葉,300 mmol/L脅迫第30天根系Na+含量分別達到了莖與葉的3倍和2倍。鹽脅迫的加重,導(dǎo)致槲樹根莖葉中K+含量不斷下降。以根系中K+變化最顯著,200 mmol/L脅迫第30天時降幅最大,下降至對照的46%。葉片中K+含量在中低濃度鹽脅迫下無明顯下降,高濃度下則顯著低于對照。隨著NaCl處理濃度的增加以及鹽脅迫時間的延長,槲樹根莖葉中Na+/K+隨鹽脅迫加重而升高,且 Na+/K+由地下向地上部分逐漸降低。根中Na+/K+最大,300 mmol//L脅迫第30天達到對照的6.25倍。

圖1 鹽脅迫下槲樹根莖葉中Na+、K+含量和Na+/K+的變化Fig.1 Changes of Na+, K+ content and Na+/K+ in the roots, stems and leaves of Q. dentata under salt stress小寫字母a、b、c、d、e表示在P<0.05水平上差異顯著

圖2表明,隨著鹽脅迫濃度和時間的增加,槲樹莖葉中Ca2+隨之升高。其在葉片中的漲幅高于莖,莖中Ca2+的變化在鹽脅迫第30天達到顯著水平,其漲幅與鹽脅迫濃度呈負相關(guān)。根系中Ca2+含量則隨鹽脅迫加重而不斷降低。300 mmol/L鹽脅迫第30天時根系中Ca2+含量降低至對照的52%。鹽脅迫下,槲樹莖葉中Mg2+含量變化大體為不斷降低,且降幅與鹽濃度呈正相關(guān),尤以莖葉更為顯著。100 mmol/L鹽脅迫第30天,其在根系中有顯著升高,含量為對照的1.22倍。

圖2 鹽脅迫下槲樹根莖葉中Ca2+、Mg2+含量變化Fig.2 Changes of Ca2+ and Mg2+ content in the roots, stems and leaves of Q. dentata under salt stress

2.2 鹽脅迫對槲樹葉片含水量的影響

如圖3,槲樹葉片含水量隨鹽脅迫的進行不斷降低,降幅與鹽濃度呈正相關(guān)。低濃度和中等濃度鹽脅迫下分別在脅迫第30天和第20天達到顯著水平,而高濃度鹽脅迫下葉片含水量在不同時間均顯著下降。300 mmol/L處理第30天時,含水量最低降至43.2%,為對照的64.1%。

圖3 鹽脅迫下槲樹葉片含水量的變化 Fig.3 Changes of Water content in the leaves of Q.dentata under salt stress

2.3 鹽脅迫對槲樹葉片膜透性的影響

由圖4可以得出,隨NaCl處理濃度的增加和鹽脅迫時間的延長,槲樹相對電導(dǎo)率和丙二醛含量均呈現(xiàn)出不斷升高的趨勢,其升高均在300 mmol/L鹽脅迫下最為顯著。中高濃度鹽脅迫下,相對電導(dǎo)率在脅迫第20天后顯著升高,第30天時電導(dǎo)率分別比20天增加了0.07和0.19。300 mmol/L處理第30天,丙二醛含量最高為68.85 nmol/g,相對電導(dǎo)率也達到0.54。

圖4 鹽脅迫下槲樹葉片相對電導(dǎo)率、丙二醛含量的變化Fig.4 Changes of Relative conductivity, Malonaldehyde content in the leaves of Q.dentata under salt stress

2.4 鹽脅迫對槲樹葉片抗氧化酶活性的影響

圖5表明,鹽濃度低于300 mmol/L時,槲樹葉片POD無明顯變化；當鹽濃度達到300 mmol/L時,隨著處理時間延長,葉片POD活性表現(xiàn)為先升高,后降低至對照以下。隨NaCl處理濃度的增加,槲樹CAT酶活性增加,當鹽濃度達到300 mmol/L時,葉片CAT活性相較于100 mmol/L和200 mmol/L脅迫時有極顯著提高。在低濃度處理下,隨處理時間延長,CAT活性呈增加趨勢,而在高濃度(300 mmol/L)NaCl處理20天,槲樹葉片CAT活性達最大值,為0.258 U/g,當脅迫時間延長到30天,其活性顯著下降到0.236 U/g。槲樹SOD活性變化規(guī)律為鹽濃度低于300 mmol/L時,SOD活性逐漸提高；鹽濃度達到300 mmol/L時,SOD活性極顯著降低,且降幅與脅迫時間呈正相關(guān)。200 mmol/L濃度NaCl處理第30天時SOD達到了2035.69 U/g；300 mmol/L濃度NaCl處理第30天時SOD低于對照,為1705.32 U/g。

圖5 鹽脅迫下槲樹葉片過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化Fig.5 Changes of POD, CAT, SOD active in the leaves of Q.dentata under salt stress

2.5 鹽脅迫對槲樹葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性糖和脯氨酸在鹽脅迫下總體表現(xiàn)為不斷積累(圖6)。低于300 mmol/L的鹽脅迫下,槲樹葉片可溶性糖和脯氨酸的積累隨濃度增加并不顯著,隨脅迫時間的延長變化顯著。當鹽脅迫濃度達到300 mmol/L,可溶性糖在脅迫第20天極顯著積累,含量達到了0.162 ug/g,在脅迫達到第30天時積累量減少至0.157 μg/g,但其積累量仍顯著高于對照。300 mmol/L鹽脅迫下,處理第20天和30天可溶性糖含量分別為0.215 μg/g和0.175 μg/g。

圖6 鹽脅迫下槲樹葉片可溶性糖、脯氨酸含量的變化Fig.6 Changes of Soluble sugar and Proline content in the leaves of Q.dentata under salt stress

3 討論

曹磊等發(fā)現(xiàn),槲樹在低濃度鹽脅迫下,生長基本正常,鹽害癥狀不明顯,當用300 mmol/L濃度NaCl處理時,隨時間延長,鹽害逐漸加強,到第30天時,所有葉片均出現(xiàn)焦葉癥狀[4]。本研究所測定的葉片離子濃度、細胞膜透性、抗氧化酶的活性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均呈現(xiàn)相應(yīng)的變化。隨著鹽脅迫的加重,槲樹光合速率、PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ光化學(xué)量子產(chǎn)量(Yield)、非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)呈下降趨勢[4]。冷平生等研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫使黃連木根莖葉中Na+含量升高,離子毒害隨即產(chǎn)生,導(dǎo)致在重度脅迫下存活率僅63%[5]。槲樹在鹽脅迫下大量吸收Na+,重度脅迫下含量達到最高,鹽害癥狀隨之產(chǎn)生,暗示其鹽害癥狀可能與離子毒害相關(guān)。NaCl脅迫下槲樹不同組織Na+含量也有差異,其主要集中在根系,地上部分在輕中度鹽脅迫下Na+積累不多,重度脅迫下Na+在根莖葉均顯著積累。在對弗吉尼亞櫟的研究中同樣發(fā)現(xiàn),弗吉尼亞櫟葉片中Na+積累少于根系[14]。王樹鳳認為這是弗吉尼亞櫟主動適應(yīng)鹽脅迫的機制,是鹽離子的區(qū)隔化[15]。本研究尚不能將此定義為槲樹鹽離子的區(qū)隔化,這可能只是槲樹通過根系的補償作用,將Na+集中在根部,減少地上部分Na+含量,從而適應(yīng)鹽脅迫的機制。在北京槲櫟中同樣發(fā)現(xiàn)了這一機制,只是其根系的代償能力有限,導(dǎo)致北京槲櫟在0.2%鹽脅迫下根系與葉片Na+含量就達到了同一水平[1]。總之,槲樹與耐鹽性強的弗吉尼亞櫟有較為相似的鹽適應(yīng)機制,其根系有一定的補償能力,在輕中度鹽脅迫下能有效的減輕地上部分離子毒害,這可能延緩了地上部分鹽害的發(fā)生。

鹽脅迫下,植物過量吸收Na+會導(dǎo)致K+、Ca2+、Mg2+的外排與流失[16]。本研究表明,槲樹在吸收Na+的同時,K+、Mg2+隨之外排,尤以K+的外排最為顯著,導(dǎo)致Na+/K+顯著升高。在對大豆(Glycinemax(Linn.)Merr.)[17]、沙棗[18]、青錢柳[10]、槲櫟[1]的研究中也得到相似結(jié)果。歐洲落葉松(LarixdeciduaMill.)在鹽脅迫下大量積累Na+和Cl-,K+卻能保持在穩(wěn)定水平[19]。這與槲樹的結(jié)果不一致,二者耐鹽機制不同,歐洲落葉松可能更依賴于維持體內(nèi)K+水平,以適應(yīng)高鹽環(huán)境。K+參與植物體內(nèi)多種酶及代謝過程[20],而較高濃度的Mg2+有利鹽生植物蛋白合成酶維持高活性[21]。隨鹽脅迫加重,K+、Mg2+流失增多,會導(dǎo)致槲樹K+和Mg2+依賴性酶的活性不斷降低,從而影響到其參與的代謝反應(yīng),并最終影響槲樹的生長。由于根系受到的離子毒害較重,槲樹K+的外排在根系最多,葉片相對較少。輕度鹽脅迫下,Mg2+含量在槲樹根系卻有一定的升高。陳少良等指出,與群眾楊(Populuspopularis‘35-44’)不同,胡楊P.euphraticaOliv)在鹽脅迫下可通過根系吸收土壤中的Mg2+和Ca2+,以維持地上部分營養(yǎng)元素水平[22]。槲樹根系Mg2+小幅升高的同時,莖葉中Mg2+的流失也相對較少,暗示槲樹可能與胡楊相同,能夠通過根系吸收Mg2+,向地上部分運輸,以維持地上部分營養(yǎng)供給。但槲樹根系吸收Mg2+能力有限,鹽脅迫加重后,根系的吸收則不能抵消離子毒害所產(chǎn)生的營養(yǎng)元素流失。槲樹根系中Ca2+含量降低,卻在莖葉中不斷積累,以葉片中積累量最大,這與沙棗[18]和青錢柳[10]的Ca2+流失有所不同。Ca2+在鹽脅迫適應(yīng)中通常被認為是陽離子穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵,在胞質(zhì)中Ca2+穩(wěn)態(tài)的建立是鹽適應(yīng)的一個必要條件[23]。槲樹根系Ca2+可能部分轉(zhuǎn)移至地上,以建立地上部分離子穩(wěn)態(tài)。李廣魯?shù)劝l(fā)現(xiàn),外源Ca2+促進冰葉日中花根尖Na+外排,抑制K+流失[24]。槲樹Ca2+的向上運輸可能是其穩(wěn)定地上部分K+、Na+平衡,適應(yīng)鹽脅迫的重要機制。

槲樹在中低濃度鹽脅迫下,葉片含水量降幅較小,幾乎無鹽害癥狀；高濃度脅迫下含水量顯著降低,葉片嚴重失水皺縮。這是鹽離子濃度過高,破壞了離子平衡,導(dǎo)致水分虧缺所致。大量Na+的積累會產(chǎn)生離子毒害,破壞細胞膜結(jié)構(gòu),相對電導(dǎo)率和丙二醛含量是反映細胞膜受損程度的重要指標,路斌[25]認為,相對電導(dǎo)率達到50%對細胞膜將有致命損傷。隨著鹽脅迫的加重,槲樹葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛含量不斷增大,槲樹細胞膜受損加重,當高濃度NaCl脅迫達到第30天時,膜脂過氧化物丙二醛含量達68.85 nmol/g,相對電導(dǎo)率為0.54,葉片受損嚴重,葉緣焦黃。在對槲櫟[1]的研究中得到相似結(jié)果,0.4%—0.6%濃度鹽脅迫下槲櫟相對電導(dǎo)率變化顯著,0.1%—0.3%濃度脅迫下則無明顯變化。李志萍等[3]對栓皮櫟的研究表明,二年生栓皮櫟在0.6%及0.8%濃度鹽脅迫后期,丙二醛含量漲幅顯著增加。槲樹與槲櫟、栓皮櫟相似,對中低濃度鹽脅迫耐受性良好。

鹽脅迫下,細胞代謝失調(diào),產(chǎn)生大量自由基和膜脂過氧化物,植物細胞膜受損,保護酶系統(tǒng)隨即被激活,SOD、POD、CAT等保護酶活性隨之升高,以清除活性氧和過氧化物,在逆境中保護植物免受氧化損傷[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn),槲樹主要依靠SOD和CAT兩種酶協(xié)同作用清除活性氧。POD活性變化不顯著,僅在重度脅迫下活性降低。這與栓皮櫟[3]的研究結(jié)果不同,二年生栓皮櫟在0.6%和0.8%濃度鹽脅迫下,三種保護酶活性均顯著升高。產(chǎn)生差異的原因可能與苗齡有關(guān),二年生幼苗相較于一年生可能在POD的抗氧化能力上有所提升；也可能是兩種櫟樹本身POD的抗氧化能力有所差異,尚需進一步研究。SOD和CAT活性升高,能有效的清除活性氧,使膜脂過氧化程度在較低水平,保證槲樹正常生長。重度鹽脅迫下,三種保護酶先后遭到破壞并逐漸失活,氧代謝紊亂,氧化脅迫最終導(dǎo)致焦葉現(xiàn)象的出現(xiàn)。王瑞剛等對于I-214楊(P.×euramericanacv. I-214.)的研究表明,鹽脅迫下,I-214楊SOD和POD活性下降后,丙二醛含量和電解質(zhì)外滲率大幅上升,其鹽害癥狀隨即顯現(xiàn)[28],這與本研究結(jié)果一致。

可溶性糖和脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),對保持原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡起重要作用,其含量與耐鹽性呈正相關(guān)[29-30]。Han等[31]發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下AtslZ1過表達株擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)耐鹽性優(yōu)于野生型,是通過促進脯氨酸和可溶性糖的積累實現(xiàn)的。本研究認為,輕中度鹽脅迫下,槲樹可溶性糖和脯氨酸均有小幅積累,對于調(diào)節(jié)槲樹滲透平衡,以及適應(yīng)鹽脅迫有所幫助。研究表明,栓皮櫟在高濃度脅迫下脯氨酸和可溶性糖均顯著積累[3],而銳齒槲櫟則無明顯滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累[1]。櫟類樹種滲透物質(zhì)的積累情況差異較大,槲樹可能介于二者之間,具有一定的滲透調(diào)節(jié)能力。綜合離子濃度的研究結(jié)果,本研究認為,槲樹的滲透調(diào)節(jié)可能更依賴于離子穩(wěn)態(tài)的建立,脯氨酸和可溶性糖的積累對槲樹的調(diào)節(jié)起輔助作用。

綜上,NaCl對槲樹的傷害主要為離子毒害作用,可導(dǎo)致細胞膜透性增大及抗氧化酶系統(tǒng)活性降低,焦葉黃斑等鹽害癥狀隨之產(chǎn)生。其主要依靠Na+在根系的積累和Ca2+向地上部分的轉(zhuǎn)運,可能通過根系少量吸收土壤中的Mg2+,建立離子穩(wěn)態(tài),以減輕地上部分離子毒害；通過提高CAT、SOD兩種保護酶活性,以緩解氧化脅迫；小幅積累脯氨酸和可溶性糖,輔助調(diào)節(jié)滲透平衡。可見槲樹具有一定的耐鹽性,能夠適應(yīng)200 mmol/L以下的鹽脅迫。由于華北地區(qū)平均土壤含鹽量在0.3%左右,最高達到了1.39%[32],低于槲樹所能適應(yīng)的鹽脅迫濃度,因此在華北平原輕、中度鹽漬化土壤的園林綠化中,可選擇槲樹試用。