五臺山亞高山土壤真菌海拔分布格局與構建機制

羅正明,劉晉仙,暴家兵,王 雪,吳 強,柴寶峰,*

1 忻州師范學院地理系,忻州 034003 2 山西大學黃土高原研究所,黃土高原生態恢復山西省重點實驗室,太原 030006 3 山西省五臺山國有林管理局,繁峙 034300

生物和生物群落的海拔分布格局與維持機制是生物地理學研究的重要議題。海拔梯度的特征是在很短的地理距離內有明顯的氣候和生態變化。因此,海拔梯度為評估地表植被周轉率、當地土壤條件和氣候狀況對生物群落空間格局的影響提供了一個重要的平臺[1]。大量的研究表明,哺乳動物、樹木、鳥類、昆蟲等大型生物類群在氣候、空間、歷史和生物等潛在力的驅動下,通常呈現單調遞減或駝峰狀的多樣性海拔分布格局[2-4]。隨著分子生物學方法在微生物生態學中的應用,近十年來,土壤微生物群落的海拔分布格局受到越來越多的關注[5-6]。盡管微生物驅動著地球上許多重要的生物地球化學循環,但與大型生物群落相比,我們對微生物多樣性的海拔分布格局還知之甚少。真菌作為土壤微生物的重要組成部分,驅動著許多關鍵的生態系統過程,包括凋落物分解、營養循環和植物生長調節[7]。許多研究已經證明真菌的多樣性隨海拔的升高而降低[8-9],而另一些報告顯示,在中海拔地區多樣性最大[10],或者沒有顯著的海拔分布模式[11]。

與動植物等大型生物相比,需要對土壤微生物群落的海拔分布模式進行更多的研究,以便更好的揭示其潛在的機制。雖然之前的研究為微生物生物地理學的解釋提供了一個概念框架,但微生物生物地理學的群落構建機制仍不清楚,且存在爭議。微生物群落構建的理論基礎主要包括生態位理論和中性理論。傳統的生態位理論(niche theory)假設環境條件(如pH、溫度、鹽和濕度)、物種特征(如豐度、代謝和形態)、物種間相互作用(如競爭、捕食、共生和權衡)等決定性因素控制著群落結構,這通常被稱為確定性過程[12-13]。相反,中性理論(neutral theory)假設群落結構獨立于物種特征,受隨機過程(如出生、死亡、物種形成、滅絕、定殖和擴散限制)控制。越來越多的研究表明,生態位理論(確定性過程)和中性理論(隨機性過程),在微生物群落構建過程中不是獨立存在的,而是共同起作用的[12, 14-16]。然而,如何定性和定量闡明它們在控制群落結構、演替和分布格局等方面的相對重要性,仍然是亟待解決的問題[8]。

五臺山(112°48′—113°55′E; 38°27′—39°15′N)位于山西省東北部,黃土高原的東緣,主峰葉斗峰為華北最高峰,高達3058 m,有“華北屋脊”之稱,是中國華北境內生物多樣性最豐富的地區之一[17]。五臺山海拔2000 m以上的地帶屬于典型的亞高山生態系統,是全球氣候變化的敏感區。五臺山亞高山地帶沿海拔梯度有明顯的植被垂直帶譜：草甸帶(海拔2800 m以上)、灌叢草甸帶(海拔2500—2800 m)、針葉林帶(海拔2000—2500 m)。在亞高山生態系統中,個體遷移、物種競爭、土壤養分轉化和微生物群落對等環境因素變化的響應可能更敏感和快速[18],這為研究生物多樣性及構建機制提供了理想的平臺。在本研究中,我們選擇五臺山亞高山生態系統中不同海拔梯度土壤真菌群落為研究對象,運用Illumina Miseq高通量測序技術,旨在探討：(1)沿海拔梯度,土壤真菌群落結構組成和多樣性分布格局；(2)影響土壤真菌多樣性和構建機制的主要驅動因子；(3)確定性過程和隨機過程在土壤真菌群落構建機制中的相對作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年8月,在五臺山北坡2000—3058 m的海拔梯度范圍內分別設立15個不同海拔的采樣點,分為3個海拔梯度：即高海拔梯度(High elevational gradient, HEG)(2900—3055 m)、中海拔梯度(Medium elevational gradient, MEG)(2500—2800 m)和低海拔梯度(Low elevational gradient, LEG)(2000—2300 m)(表1),每個海拔梯度包含5個不同的采樣點。在每個采樣點,設置3個1 m×1 m的樣方,樣方之間間隔約20 m。用土鉆采集表層土壤樣品(0—10 cm),每個樣方內采集5個子樣(每個角1個,中心1個),在聚乙烯袋中混合成一個樣品。經2 mm網篩,將大部分根、動物和石頭去除,然后將樣本分成兩部分。其中一部分風干后進行理化分析,另一部分保存在-80℃冰箱中,用于DNA的提取。在每個樣方中調查植被參數,記錄每種植物的名稱、高度、蓋度及多度等指標。植物的豐富度指數(richness)采用單位面積內的物種數目來測度物種的豐富程度。

表1 不同海拔梯度下土壤理化性質與植物多樣性參數Table 1 Soil physical and chemical properties and plant diversity parameters under different along elevational gradients

1.2 土壤理化性質測定

1.3 DNA提取及Miseq高通量測序

稱取0.5 g土壤樣品,使用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒(Omega Bio-tek, USA)按照試劑盒使用說明書步驟提取和純化土壤微生物DNA。將每個采樣點的3個土壤樣品等體積混合,一共15個DNA樣品,送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序。采用ITS1F(正向引物5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(反向引物5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對真菌核糖體的ITS1高可變區進行PCR擴增,并通過Illumina Miseq測序平臺對擴增產物進行測序。剔除嵌合序列后,剩下的序列使用UPARSE以97%的相似性作為閾值劃分分類操作單元(Operational taxonomic units,OTUs)。

1.4 數據分析

基于R studio(v.3.4.3)vegan包,計算真菌和植物的α多樣性(Shannon指數和Richness指數)和β多樣性(每對樣本之間的Bray-Curtis差異),以及采用非度量多維尺度分析(Non-metric multidimensional scaling,NMDS)和相似性分析(Analysis of similarity,ANOSIM)對不同海拔梯度間真菌群落組成進行了比較。用鄰體矩陣主坐標(Principal coordinates of neighbor matrices,PCNM)分析空間變量對土壤真菌群落的影響,用R studio(v.3.4.3)vegan包中的PCNM函數進行前選擇,篩選出顯著的PCNM空間變量(P<0.05)。基于CANOCO 5.0軟件,采用典范對應分析(Canonical correspondence analysis,CCA)評價真菌群落結構與環境變量之間的相關性。在CCA之前,使用逐步回歸和蒙特卡羅置換測試對所有環境變量進行前選擇,選擇具有統計學意義(P<0.05)的環境變量進行下一步分析。采用Mantel和Partial Mantel檢驗評價了真菌群落與環境變量和空間距離的相關性。采用方差分解分析(Variance partitioning analysis, VPA)測量環境變量和空間變量對真菌群落結構變化的相對貢獻。環境變量和空間距離的變量在VPA之前都進行了前選擇(CANOCO 5.0)。利用IBM SPSS statistics 20進行皮爾遜相關性分析(Pearson correlation test)以及采用單因素方差分析(One-way analysis of variance)和Duncan多重比較分析進行顯著性差異分析,顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質和植被參數

2.2 真菌群落組成和多樣性

圖1 三個海拔梯度土壤優勢真菌門(平均相對豐度> 1%)的相對豐度Fig.1 Relative abundance of the dominant fungal phyla (with average relative abundance > 1%) among three elevational gradients LEG：低海拔梯度,Low elevational gradient；MEG：中海拔梯度,Medium elevational gradient；HEG：高海拔梯度,High elevational gradient

通過高通量測序,在15個樣本中共檢測到994035個真菌序列,樣本的序列條數分布在 49957—78813之間(每個樣品平均66269個)。按最小樣本序列數(49957)抽平,共鑒定出3752個OUT (>97%序列相似性水平)。15個樣地中共鑒定出子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridimycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、芽枝霉門(Blastocladiomycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)7個真菌門,包括32個綱、106個目、225個科、482個屬和759個種。其中子囊菌門、擔子菌門、接合菌門和羅茲菌門(相對豐度為>1%)被定義為優勢門(圖1)。圖1中可以看出,隨海拔升高,子囊菌門、擔子菌門和羅茲菌門的相對豐度沒有明顯的變化趨勢,而接合菌門的相對豐度隨著海拔升高呈明顯上升的趨勢。

通過分析土壤真菌群落α多樣性與海拔的相關關系,來確定土壤真菌群落α多樣性的海拔分布格局。結果表明,土壤真菌群落 Shannon 指數和 richness 指數均與海拔高度呈顯著的負相關(r=-0.581,P<0.05),隨海拔的升高,α多樣性呈下降的趨勢(圖2)。基于Bray-Curtis距離計算土壤真菌群落的β多樣性,并確定了土壤真菌群落β多樣性與海拔距離(歐式距離)的相關關系。結果表明,在亞高山生態系統中,土壤真菌群落之間的相異性隨著海拔距離的增加而顯著升高(r=0.464,P<0.001)(圖3)。這說明亞高山帶不同海拔梯度上的環境差異是影響真菌群落多樣性和生物地理分布格局的重要因素。

圖2 海拔與土壤真菌α多樣性的關系 Fig.2 Relationship between elevation and soil fungal diversity

圖3 土壤真菌β多樣性與海拔距離(歐式距離)的關系 Fig.3 Relationship between soil fungal β-diversity and elevational distance(Euclidean distance)

基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析(NMDS)分析了沿海拔梯度土壤真菌群落結構的變化(圖4),高、中、低海拔梯度的樣本基本分離。利用相似性分析(ANOSIM)進一步對3個海拔梯度土壤微生物群落的群落結構差異性進行了分析。結果顯示真菌群落組成在3個海拔梯度上均有顯著性差異(P<0.001)(圖4)。進一步表明土壤真菌物種多樣性和群落組成具有明顯的海拔分異。

圖4 基于Bray-Curtis距離的真菌非度量多維尺度分析(NMDS)Fig.4 Non-metric multidimensional scaling (NMDS) of soil fungal community along the elevational gradient圖中r =0.645, P<0.001為不同海拔梯度之間相似性的ANOSIM檢驗結果; LEG1：低海拔梯度樣本1,Low elevational gradient sample 1；LEG2：低海拔梯度樣本2,Low elevational gradient sample 2；LEG3：低海拔梯度樣本3,Low elevational gradient sample 3；MEG1：中海拔梯度樣本1,Medium elevational gradient sample 1；MEG2：中海拔梯度樣本2,Medium elevational gradient sample 2；MEG3：中海拔梯度樣本3,Medium elevational gradient sample 3；HEG1：高海拔梯度樣本1,High elevational gradient sample 1；HEG2：高海拔梯度樣本2,High elevational gradient sample 2；HEG3：高海拔梯度樣本3,High elevational gradient sample 3

2.3 影響土壤真菌群落變化的環境因子和空間變量

為了探索海拔梯度下土壤真菌群落形成和變化的關鍵環境驅動因子,采用CCA對環境變量進行了分析。軸1和軸2分別解釋變異量24.1%和14.0%,說明環境因子對真菌群落結構具有很大的影響。其中pH、植物豐富度、總碳含量顯著影響了土壤真菌群落結構變化(P<0.05),是最重要的環境驅動因子(圖5)。

圖5 土壤真菌的群落結構與環境因子的CCA分析 Fig.5 Canonical correspondence analysis (CCA) of soil fungal community structure with environmental factorsTC：總碳含量,Total carbon；Plant richness：植物豐富度指數,Plant richness index

為了進一步了解植被參數對土壤真菌群落的影響,分析了土壤真菌群落與植物多樣性之間的相關關系(圖6)。結果表明,土壤真菌和植物的豐富度指數顯著相關(r=0.691,P=0.004),它們之間的β多樣性也有顯著的相關關系(r=0.418,P<0.001)。這些結果進一步表明植物群落組成對五臺山北坡海拔梯度上的土壤真菌群落具有重要影響。

圖6 土壤真菌群落與植物多樣性之間的相關關系Fig.6 Relationship between soil fungal community and plant diversity

為了探討確定性過程和隨機過程在亞高山土壤真菌群落生物地理學海拔分布格局的相對作用。通過空間變量(PCNM特征向量)和環境因子之間的VPA分析,定量了兩者對土壤真菌群落變化的相對重要性。結果表明環境因子和空間變量共解釋了真菌群落變異的52.8%,其中環境因子單獨解釋了24.4%,空間變量單獨解釋了2.0%,環境因子對群落結構變異的貢獻遠大于空間變量(圖7)。說明土壤真菌群落構建過程中,確定性和隨機性過程都起作用,而且確定性過程占絕對的優勢。通過Mantel和Partial Mantel分析進一步驗證了環境因子和空間變量對真菌群落結構的影響(圖7)。結果表明無論環境因子和空間變量單獨還是共同作用,對真菌群落結構變化均有顯著影響(P<0.05),進一步證實確定性過程和隨機性過程在微生物群落構建過程中是共同起作用的。

圖7 環境因子與空間變量對土壤真菌群落影響的VPA分析和Partial Mantel分析 Fig.7 VPA and Partial Mantel test of the effects of environmental factors and spatial variables on soil fungal communities* P<0.05； ** P<0.01；E：環境變量,Environmental variables；S：空間變量,Spatial variation；E|S：單獨的環境變量,Pure environmental variation；S|E：單獨的空間變量,Pure spatial variation； E∩S：環境與空間共同解釋的變量,Share explained variation

3 討論

海拔多樣性分布格局是生物地理學中最基本的模式之一。本研究中,真菌群落α多樣性隨海拔高度的增加呈線性減少(圖2),這與Bahram等[9]和Shen等[19]報道的一致。目前土壤真菌多樣性的海拔分布格局尚存在一些爭議,表現出下降、駝峰、U型和無趨勢等多種海拔分布格局。例如,Bahram等[9]發現,伊朗北部溫帶原生林外生菌根真菌物種豐富度隨海拔升高而單調下降。Miyamoto 等[20]用日本富士山海拔梯度上外生菌根真菌物種豐富度呈單峰分布的格局。Shen等[11]的研究結果表明長白山土壤真菌的豐富度與海拔高度無關,但與土壤pH值有很強的相關性。Wang等[21]發現,青藏高原色季拉山海拔3106 m至4479 m的土壤真菌的物種豐富度呈U型的趨勢。有研究表明同一山地生態系統由于不同海拔區域之間的環境條件顯著不同,在不同海拔上的真菌群落在適應環境變化的能力也不同[22]。說明土壤真菌多樣性海拔分布格局的不同主要是不同區域的環境差異引起的,特別是影響群落構建的關鍵環境因子,使其海拔分布格局的內在機制不一樣。

本研究結果表明,確定性過程和隨機過程對真菌群落海拔分布格局均有顯著影響(圖7),但是確定性過程的相對作用(24.4%)明顯大于隨機性過程(2.0%),這表明在五臺山亞高山生態系統,土壤真菌群落的海拔分布格局和構建過程中,確定性過程(中性理論)起主導作用。土壤真菌群落之間的相異性(基于Bray-Curtis 距離)隨海拔距離的增加而顯著增加(圖3),說明環境過濾是五臺山亞高山土壤真菌群落海拔分布格局的主要驅動力。這與喬沙沙[23]和趙鵬宇[24]的研究結果一致,真菌群落結構主要受到確定性過程(環境選擇)的影響,而空間變量對真菌群落構建的相對作用較弱(圖7)。因此,確定性過程主導了五臺山局域海拔尺度下土壤真菌群落分布模式的很大程度的變異。這主要是因為海拔梯度上的生態環境顯著不同[5],對土壤微生物產生了環境過濾的作用,從而導致土壤真菌群落的結構和組成在不同海拔存在明顯的差異。隨著空間距離的增加,影響選擇過程的環境因子也會增加,難以產生很強的擴散性。

土壤pH、植物豐富度和總碳含量是真菌群落組成變化的主要驅動因子。在以往的許多研究中,土壤 pH都被認為是影響微生物包括真菌群落的關鍵因子[5, 21],對土壤真菌的生長繁殖以及胞外酶的分泌均具有顯著影響。我們的結果顯示土壤pH是影響土壤真菌群落結構沿海拔梯度變化的最重要環境因子(圖5)。目前許多研究都證實了土壤pH值對真菌群落具有較強的影響。Liu等[5]發現pH值是中國西南地區沿海拔梯度土壤真菌多樣性的一個重要預測因子,且土壤pH值越高,土壤真菌多樣性指數越高。另一個在長白山對微生物和植物的海拔分布模式的研究發現,土壤pH對真菌群落多樣性的海拔分布模式和群落結構的海拔分異均有顯著的影響[11]。本研究區在中、高海拔梯度的過酸性土壤可能會限制大部分土壤真菌的生長和繁殖,從而使中、高海拔梯度的多樣性降低。這一結果得到了pH控制實驗的支持,該實驗表明,較低的pH值可以維持微生物群落的穩定,但不能促進微生物群落的大量繁殖[25]。

關于植物豐富度和總碳含量對真菌群落的重要影響,我們的結果證實植物物種豐富度是真菌豐富度和群落結構的重要預測因子(圖5和圖6)。真菌與植物關系非常密切,在陸地生態系統中扮演著植物分解者、病原體和共生體等重要角色[26]。由于根深、根系分泌物、冠層覆蓋度和凋落物質量及數量的不同,植物種類及其群落組成也會影響微生物群落結構[27]。目前,關于植物多樣性與土壤真菌群落結構之間的相關性還沒有一致的定論。Tedersoo等[7]在全球尺度的研究中發現,土壤真菌豐富度與植物多樣性之間僅存在微弱的間接關系。在全球范圍內,真菌群落受到氣候和土壤因子的強烈影響,也受到區域進化和滅絕的歷史影響,這可能掩蓋了植物多樣性與真菌多樣性之間的關系。因此,全球或大陸尺度的研究可能不適用于處理土壤真菌多樣性與植物多樣性之間的微妙聯系[26]。此外,生物群體之間的相互作用和共同進化被認為主要發生在局部到區域尺度上[28],因此,植物多樣性效應可能更傾向于在這些尺度上表達。本研究CCA和皮爾森相關關系分析結果顯示(圖5和6),在局域海拔尺度上土壤真菌多樣性與植物多樣性(α和β多樣性)呈顯著正相關關系。這表明植物多樣性和真菌多樣性之間在局域海拔尺度下具有交互關系,這與之前發現兩者之間具有互利共生機制相一致[29]。植物多樣性對土壤真菌多樣性的顯著影響具有重要的生態學意義。說明即使是草地植物的小個體,也可能通過提供不同質量的根環境、分泌物、根和葉凋落物而產生互補的地下生態位,從而可以支持各種生物營養真菌和腐生真菌有更大的多樣性[29]。此外,真菌與寄主植物的遺傳相容性是真菌多樣性效應的另一種潛在機制[30]。以往的研究表明,真菌多樣性和群落結構的變化可能受土壤養分的調控[31]。土壤碳是真菌的基本能量來源和組成元素,可利用碳的多少可以影響土壤真菌的海拔分布[32]。本文的研究結果也證實了這一觀點。

4 結論

我們通過Illumina Miseq高通量測序技術分析了五臺山亞高山土壤真菌多樣性分布格局以及群落構建機制。不同海拔梯度土壤真菌群落的組成和多樣性之間存在顯著差異,并且沿著海拔升高而多樣性呈現顯著下降的趨勢。在局域海拔尺度下,土壤真菌多樣性與植物多樣性(α和β多樣性)呈顯著正相關關系。確定性過程和隨機過程共同驅動了五臺山亞高山土壤真菌的海拔多樣性分布格局,但確定性過程占主導地位。土壤pH、植物豐富度和總碳含量是影響真菌群落組成變化的主要環境因子。本研究結果不僅有助于了解局域海拔尺度下,真菌群落的構建機制,也為預測微生物群落對環境條件變化的響應、適應和反饋提供理論依據。

致謝：本項目采樣過程得到山西省五臺山國有林管理局李吉龍和李勇的協助,特此致謝。