趨化因子受體CX3CR1 基因V249I 多態性在云南彝族人群中的分布

楊 鈺 ，楊靖宜，陳志彬，陳燦昆，范志祥，張延潔，張 璐，萬瑞雪，龍 莉

（1） 昆明醫科大學，云南昆明 650031；2） 昆明醫科大學細胞生物學與醫學遺傳學系，云南昆明 650500；3） 昆明醫科大學第一附屬醫院遺傳科，云南昆明 650101）

CX3CR1為G-蛋白偶聯受體，須與Fractalkine（Fkn） 相結合方可發揮生物學作用，導致炎癥發生。CX3CR1 基因共含1065 個核苷酸，可編碼355 個氨基酸，位于3p21 -3pter[1]。McDemott 等[2]發現其跨膜結構區共有5 個單核苷酸多態位點（SNP），而V249I 多態位點就是其中之一。V249I 多態性是指位于CX3CR1 基因第二外顯子上的745 位點堿基發生G→A 突變，使得相應的密碼子由纈氨酸（V） 轉為異亮氨酸（I）[3]。V249I（G→A） 多態位點位于CX3CR1 基因編碼區，故其可影響蛋白質翻譯，從而影響受體功能[4]。V249I突變影響炎癥進程中白細胞尤其是吞噬細胞、淋巴細胞的游走與活化并介導細胞間黏附聚集等作用，甚至可能影響疾病遺傳易感性[5]?，F已發現V249I 多態與多種炎癥性疾病和某些傳染性疾病的發生發展相關[6]，但其機制目前為止尚未完全明確。本文著力于研究、描述云南省晉寧縣彝族健康人群CX3CR1 基因V249I 位點多態分布情況及其與國內外不同種族及不同民族之間的差異，為探索CX3CR1 基因相關疾病分子機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

昆明市晉寧縣雙河彝族鄉彝族健康村民共245人，其中男性82 例，女性163 例，平均年齡（60.2±12.1） 歲；經病史調查、體檢報告、實驗室檢查等資料將高血壓、冠心病、心肌病、先天性心臟病和瓣膜性心臟病患者排除在外。本研究已通過倫理道德審查且所有對象對調查、取樣項目知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 提取抽取靜脈血2 mL 后采用EDTA 抗凝，使白細胞分離，低滲溶血，酚-氯仿有機抽提法提取基因組DNA，TE 緩沖液溶解，4℃冰箱儲存。

1.2.2 目的片段的PCR 擴增采用PCR 技術特異性擴增CX3CR1 基因的一段包含V249I 位點的DNA 引物序列。上游引物為：5'-CCGAGGTCCTCCAGGAAATCT-3'；下游引物為5'-TCAGCATC AGGTTCAGGAACTC-3'；30 μL PCR反應體系包含：正反引物各1.3 μL，TaqDNA 聚合酶15 μL（北京擎科新業生物技術有限公司），雙蒸水（ddH2O） 11.4 μL，DNA 樣本1 μL。PCR 反應條件如下：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，循環35 次；于72 ℃延伸10 min。

1.2.3 基因型鑒別采用RFLP 法檢測基因型。酶切體系共18 μL：PCR 擴增產物6 μL，0.5 μL 限制性內切酶Acl I（Bio Basic 公司），雙蒸水（ddH2O）8.8 μL，10×Buffer2.7 μL，37℃孵育過夜（24～36 h）。反應終止后將消化片段于2.5%瓊脂糖凝膠上電泳（添加Goldview-I 型核酸染色劑），凝膠成像系統判斷酶切結果。

1.3 統計學處理

數據處理采用SPSS 軟件。χ2檢驗分析基因型及等位基因頻率，且檢驗Hardy-Weinberg 平衡定律，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢測

分析結果為χ2=3.286，P=0.279，說明CX3CR1 基因 V249I 位點多態性分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，即所選用的人群樣本具有群體代表性，結果具有說服力。

2.2 基因型鑒定

PCR 擴增產物片段大小為588 bp。該片段用限制性內切酶Acl I 進行酶切時，若CX3CR1 基因745 位點沒發生突變，編碼的氨基酸為G，則擴增產物被Acl I 切開會產生205 bp、383 bp 二個片段；若745 位點的G 被A 替代，編碼的氨基酸變為I，原有的Acl I 酶切位點消失，Acl I 無法切開，即長度不變。酶切后產生2 個等位基因V、I，形成3種基因型：II：只產生588 bp 一個片段（無突變純合子） VV：產生205 bp、383 bp 二個片段（突變雜合子）；VI：產生588 bp、383 bp 和205 bp 三個片段（突變雜合子），見圖1。

圖1 CX3CR1 基因V249I 多態性3 種基因型凝膠電泳圖Fig.1 Three genotype of CX3CR1 gene V249I polymorphism were showed by agarose electrophoresis image

2.3 V249I 多態性在云南彝族人群中的分布

昆明市晉寧縣雙河鄉245 例彝族健康人群中，CX3CR1 基因249I 位點有VV、VI、II 三種基因型，其基因型頻率分別為86.53%、12.25%、1.22%；V、I 等位基因頻率分別為92.65%和7.35%。在男性中，基因型頻率為VV（91.46%）、VI（7.32%）、II（1.22%）；V、I 等位基因頻率分別為95.12%、4.88%。在女性中，基因型頻率為VV（84.05%）、VI（14.72%）、II（1.23%）；V、I等位基因頻率則分別為91.41%、8.59%。經過比較，在不同性別中該位點的多態性分布無顯著差異（基因型為χ2=2.791，P=0.248；等位基因為χ2=2.207，P=0.137），見表1。

2.4 CX3CR1 基因V249I 多態性分布與其它文獻報道的比較

現將國內外報道的不同種族或民族人群CX3CR1 基因位點多態性分布的研究結果與本研究進行比較，結果顯示：云南彝族健康人群中V249I多態性位點以VV 型為主，日本人、傣族人、景頗族人、漢族人、新疆漢族人、湖南漢族人、包頭漢族人群缺少II 基因型。云南彝族與報道的日本人[7]、法國人[8]、意大利人[9]、高加索人[10]、希臘人[11]、印度[12]人、塞爾維亞人[13]、維吾爾族人[14]、新疆漢族人[14]、漢族人[15]比較，其CX3CR1 基因型分布與基因頻率差異均有統計學意義（P＜0.05）。與景頗族人[16]、傣族人[16]、湖南漢族人[17]、包頭漢族人[18]相比無論從基因型分布或是基因頻率均無統計學差異（P＞0.05）。

云南彝族人群VV 基因型頻率為86.53%，顯著高于已報道的維吾爾族人（72.45%）、塞爾維亞人（62.60%）、意大利人（52.94%）、希臘人（52.12%）、高加索人（50.60%）、法國人（50.32%）、印度人（50.00%），P＜0.05；但顯著低于新疆漢族人（95.74%）、漢族人（95.24%）、日本人（91.83%），P＜0.05；云南彝族人群VI 基因型頻率為12.25%，高于漢族人（4.76%）、新疆漢族人（4.26%），P＜0.05；同時低于法國人（43.34%）、高加索人（41.77%）、意大利人（41.18%）、印度人（39.33%）、希臘人（35.76%）、塞爾維亞人（32.47%） 和維吾爾族人（23.47%）（P＜0.05）；云南彝族人群II 基因型頻率為1.22%，顯著低于希臘人（12.12%）、印度人（10.67%）、高加索人（7.63%）、法國人（6.34%）、意大利（5.88%）、塞爾維亞人（4.30%），P＜0.05。

云南彝族人群V 等位基因頻率為92.65%，顯著高于維吾爾族人（84.18%）、塞爾維亞人（78.83%）、意大利人（73.53%）、法國人（71.96%）、高加索人（71.49%）、希臘人（70.0%）和印度人（69.69%），P＜0.01；低于新疆漢族人（97.87%） 和漢族人 （97.60%）、日本人（95.92%），P＜0.01。云南彝族人群I 等位基因頻率為7.35%，低于印度人（30.31%）、希臘人（30.00%）、塞爾維亞人（21.17%）、高加索人（28.51%）、法國人（28.04%）、意大利人（26.47%） 和維吾爾族人（15.82%），P＜0.01，但高于日本人（4.08%）、漢族人（2.40%） 和新疆漢族人（2.13%），P＜0.01，與其他民族比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 彝族CXC3R1 基因V/I 多態性的分布［n（%）］Tab.1 Distribution of CX3CR1 gene V249I polymorphism in Yi nationality population ［n（%）］

表2 不同人群CXC3R1 基因V249I 多態性基因型頻率和等位基因頻率［n（%）］Tab.2 Genotype frequency and gene frequency of CX3CR1 gene V249I polymorphism comparison between Yi nationality and other populations ［n（%）］

3 討論

Fkn 是CX3C 趨化因子家族中獨特的促炎因子，以可溶性和膜結合形式存在，主要由大腦、心臟及外周血管內皮細胞表達。其特異性受體CX3CR1 存在于單核細胞、NK 細胞、T 細胞膜上，兩者之間相互作用可導致炎癥發生[19]?，F已發現CX3CR1 基因V249I 多態性與某些傳染性疾病以及多種炎性疾病的發生發展相關。朱阿楠[20]等發現V249I 突變對Fkn 趨化活性、結合率均下降，并減緩糖尿病腎?。―N） 進程。例如Combadiere 等[21]發現CX3CR1 基因V249I 多態性與年齡相關性黃斑變性（AMD） 相關。Moatti 等[22]發現CX3CRl 上只有I 等位基因可用于預測評估急性冠狀動脈綜合征的發病風險，說明Fkn 分子與血管性疾病有相關性；正如李文龍等[23]的研究顯示：冠狀動脈硬化性疾病（CAD） 患者的V249I 頻率較低，即推測V249I 多態是CAD 的保護性因素。近年有研究發現V249I 多態可能為缺血性腦血管病（ICVD） 的遺傳易感因素[24]，且體外試驗證實V249I 多態性還在腎小球腎炎發病中起作用[25]。但CX3CR1 基因V249I 多態與疾病的關系，在不同的民族或種族中，可能會得出不同的結論。如劉明旭等[14]檢測到V249I 多態性可能與新疆維吾爾人群中HIV-1 易感性有關；而鄧小玲等[26]卻推測四川彝族人群HIV-1 感染者與正常人中V249I 多態分布無顯著差異。這可能是由于不同民族遺傳背景不同導致對疾病易感性存在差異。除了上述慢性病外，最近的研究提示V249I 多態性還與腫瘤的發生過程相關[27]；瘤內CX3CL1-CX3CR1 信號被證明直接影響膠質瘤的侵襲和粘連行為，V249I 多態性提高膠質瘤患者術后的總存活率，減少TAM 浸潤。

云南彝族與其他民族和種族具有不同的遺傳背景，如龍莉等[28-33]發現M235T、T280M 等多種基因的多個多態位點在云南彝族與其他民族或種族中的分布均有顯著差異。但目前國內外對于云南彝族CX3CR1 基因V249I 位點多態性的研究較少，對云南彝族進行基因層面的研究可為目前提倡精準醫療，個體化醫療方案提供一定證據。本研究對部分已報道種族、民族CX3CR1 基因V249I 多態性分布進行收集、描述統計，結果顯示：云南彝族與報道的日本人、法國人、意大利人、高加索人、希臘人、印度人、塞爾維亞人、維吾爾族、漢族、新疆漢族比較，V249I 基因型分布與基因頻率差異均有統計學意義（P＜0.05）。這說明在不同地域、不同種族的健康人群中，V249I 基因型及其等位基因頻率分布存在差異，其中以不同種族之間的差異更為顯著。

以上國內外研究進展與結果都提示趨化因子受體CX3CR1 在炎性疾病、AMD 與AIDS 等疾病進程中發揮重要作用，而V249I 多態性很大程度上影響著CX3CR1 的表達。各種族與民族遺傳背景的不同使得其疾病發生與發展可能存在差異，通過研究人類基因多態性，可掌握基因在不同人群中的分布狀況，從基因水平對疾病在不同民族、種族中表現的易感性、發病率差異的潛在機制進行初步探索。此外，開展多地區、大樣本的研究并對CX3CR1 的其他多態位點進行篩查，有助于明確CX3CR1 基因多態性在疾病發生發展中的作用，為疾病排查、治療提供新的靶點。