枸杞多糖在AP小鼠體內(nèi)抗炎、抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制

唐開(kāi)鋒 王劍虹 余家奇

(遵義市第一人民醫(yī)院 1藥劑科，貴州 遵義 563000；2質(zhì)量管理辦公室)

急性胰腺炎(AP)為臨床上常見(jiàn)的急腹癥之一，且為消化科住院患者的主要病因〔1〕。AP患者的病死率為5%～10%，若AP患者得不到及時(shí)干預(yù)會(huì)很快發(fā)展為急性重癥胰腺炎(SAP)，出現(xiàn)多臟器損傷和功能衰竭，死亡率高達(dá)30%〔2〕。隨著對(duì)AP療效研究的不斷深入，目前在西藥的常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合中藥治療可提高治療效果，減少并發(fā)癥。

枸杞多糖(LBP)是一種從植物枸杞子中提取的水溶性多糖，為枸杞中的主要活性成分〔3〕，為多糖和蛋白聚糖的混合物〔4〕，具有抗腫瘤、抗衰老、抗應(yīng)激、保肝、保護(hù)神經(jīng)、降血脂、雙向調(diào)節(jié)血糖、增強(qiáng)免疫的功效，更顯著的為抗炎、抗氧化作用，其能有效抑制與慢性炎癥相關(guān)的損傷〔5〕。LBP在糖尿病〔6，7〕、結(jié)腸癌〔8〕、神經(jīng)膠質(zhì)損傷〔9，10〕、視網(wǎng)膜損傷〔11〕、卵巢上皮血管損傷〔12〕、腎癌〔13〕、肝癌及肝損傷〔14～16〕和膀胱癌〔17〕中均具有保護(hù)作用。但LBP在AP中的功能尚未完全清楚。

炎性介質(zhì)的釋放失控造成機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的紊亂，機(jī)體抗炎因子與促炎因子的分泌失衡，有可能會(huì)導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征〔18〕。其中與AP相關(guān)的保護(hù)性炎癥介質(zhì)有白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-2、可溶性腫瘤壞死因子受體(STNFR)、IL-1ra、前列環(huán)素(PGI)2和一氧化氮(NO)等。NF-κB 信號(hào)通路能調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞素、趨化因子等內(nèi)在基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)等病理過(guò)程，其與炎癥性疾病關(guān)系密切〔19〕。AP發(fā)病早期炎癥反應(yīng)的主要病因是胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)酶源被異常激活，大量的細(xì)胞因子IL-6、IL-2、IL-β和TNF-α也被激活，其在AP發(fā)生發(fā)展中具有重要作用〔20，21〕。氧化應(yīng)激是機(jī)體氧化和抗氧化作用失衡，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激為急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的中藥調(diào)節(jié)器〔22，23〕。氧自由基(OFR)和促炎因子的作用在AP發(fā)病機(jī)制中均具有重要作用〔24〕。大量研究證實(shí)，LBP具有抗炎、抗氧化應(yīng)激作用及炎癥和氧化應(yīng)激在AP中的重要作用〔9，13，21，25〕。但LBP在AP中對(duì)炎癥和氧化應(yīng)激的作用機(jī)制尚未研究。本研究擬用LBP治療AP模型小鼠，分析血清中炎性因子的含量和胰腺組織中氧自由基相關(guān)指標(biāo)的變化及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性昆明鼠54只，18～20 g，購(gòu)自上海凱學(xué)生物科技有限公司。

1.2主要藥物、試劑和儀器 LBP購(gòu)自西安森冉生物工程有限公司；雨蛙素、脂多糖(LPS)購(gòu)自北京寶奧萊博公司；髓過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購(gòu)自南京建成研究所；雨蛙素購(gòu)自Sigma公司；炎性因子IL-6、IL-β、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)；MDA競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自加拿大ELIXIR公司；MPO夾心ELISA試劑盒、SOD ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bioxytech；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自大連Takara公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3AP模型的建立 將54只小鼠隨機(jī)分成3組，每組18只，分別為對(duì)照組(滅菌生理鹽水)，AP組(雨蛙素聯(lián)合脂多糖)和LBP組(雨蛙素聯(lián)合LPS+LBP)。造模前12 h小鼠禁水不禁食。雨蛙素為1 mg/ml，每次間隔1 h，連續(xù)給藥6次，最后一次另給藥后再給藥10 mg/ml LPS，即完成造模。治療組在造模結(jié)束0 h和4 h腹腔注射5 mg/ml LBP。

1.4胰腺系數(shù) 將對(duì)照組、AP組和LBP組小鼠稱重，眼球采血，斷頸法處死，摘取完整的胰腺組織并稱重。胰腺系數(shù)=胰腺濕重(mg)/小鼠體重(g)。

1.5胰腺組織病理評(píng)分 運(yùn)用Rongione病例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)對(duì)照組、AP組和LBP組小鼠胰腺組織的病理變化進(jìn)行評(píng)分。光鏡下觀察3組胰腺：胰腺的體積、邊界；腺小葉的結(jié)構(gòu)形態(tài)、中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞的浸潤(rùn)、水腫；腺泡的輪廓，結(jié)構(gòu)的完整度，胞核胞仁的著色；是否有出血壞死病變等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.6ELISA 用ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清中IL-6、IL-β、TNF-α的含量。采用競(jìng)爭(zhēng)性抑制ELISA試劑盒檢測(cè)MDA；夾心ELISA試劑盒檢測(cè)MPO；ELISA試劑盒檢測(cè)SOD。

1.7qRT-PCR 用無(wú)菌生理鹽水研磨胰腺組織，用RNA抽提試劑盒提取總RNA，微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。最后按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)樣品中p65 mRNA的表達(dá)，用2-△△Ct計(jì)算p65的相對(duì)表達(dá)水平，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

1.8Western印跡 用無(wú)菌生理鹽水研磨胰腺組織，低溫離心后提取細(xì)胞核蛋白，BCA法進(jìn)行定量。按照Western印跡實(shí)驗(yàn)常規(guī)操作流程進(jìn)行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。Image J分析目的條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示p65蛋白的表達(dá)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組胰腺系數(shù)比較 AP組胰腺系數(shù)(11.49±0.83)顯著高于對(duì)照組(5.83±0.16)，LBP組(8.12±0.47)顯著低于AP組，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=77.993，P=0.000)。

2.2各組胰腺組織損傷情況比較 AP組胰腺組織病例評(píng)分〔(6.53±0.73)分〕顯著高于對(duì)照組〔(0.22±0.04)分〕，LBP組〔(5.16±0.45)分〕顯著低于AP組，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=134.525,P=0.000)。

2.3各組炎性因子表達(dá)比較 AP組IL-6、IL-β、TNF-α水平顯著高于對(duì)照組，LBP組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組IL-6、IL-β、TNF-α水平比較

2.4LBP對(duì)小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響 AP組MDA、MPO水平顯著高于對(duì)照組，LBP組顯著低于AP組(P<0.05)；AP組SOD水平顯著低于對(duì)照組，LBP組顯著高于AP組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組MDA、SOD、MPO水平比較

2.5LBP對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響 AP組p65 mRNA、p65蛋白表達(dá)(1.83±0.15，0.76±0.06)顯著高于對(duì)照組(1.01±0.08，0.38±0.04；P<0.05)，LBP組(1.19±0.10，0.57±0.05)顯著低于AP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 LBP對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為AP是暴飲暴食、酗酒、高鈣血癥、高脂血癥、感染和某些藥物引起的膽汁胰液逆流，激活胰酶使胰管壓力增高，部分胰管破裂，進(jìn)而胰液滲入胰間質(zhì)導(dǎo)致胰腺的自我消化，其在AP的治療上以抑制胰腺的分泌功能為主。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為AP的發(fā)生多由六淫之邪、飲食不節(jié)、情志失暢、創(chuàng)傷等引起肝郁氣滯、肝膽濕熱、胃腸熱結(jié)，其在治療上以通導(dǎo)為主〔25〕。目前，臨床上多采用中西醫(yī)結(jié)合的方法治療胰腺炎。

枸杞子為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材。《本草綱目》記載“枸杞，補(bǔ)腎生精，養(yǎng)肝，明目，堅(jiān)精骨，去疲勞，易顏色，變白，明目安神，令人長(zhǎng)壽”，故有“紅寶”之稱〔26〕。枸杞子富含LBP、甜菜堿、氨基酸、胡蘿卜素、維生素B、維生素C、鈣、磷、鐵等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。LBP為枸杞子的主要活性成分，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖6種單糖組成，含有多種微量元素和氨基酸的蛋白雜多糖〔27〕。王建東等〔28〕以灘羊?yàn)檠芯繉?duì)象，用LBP飼喂灘羊發(fā)現(xiàn)，LBP可提高灘羊抗體水平和細(xì)胞因子的分泌；王曉麗等〔29〕在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，LBP能抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的損傷，對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。大量研究顯示，LBP對(duì)多種疾病損傷和腫瘤均具有保護(hù)作用〔26～29〕。本研究結(jié)果顯示，LBP對(duì)雨蛙素聯(lián)合LPS誘導(dǎo)小鼠胰腺損傷具有保護(hù)作用。

NF-κB為一種可以調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB被活化后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)炎性因子TNFα、IL-1β、IL-6和iNOS等炎癥基因進(jìn)行表達(dá)〔30〕。Jin等〔31〕研究報(bào)道，LBP可抑制NF-κB通路，下調(diào)促炎介質(zhì)和趨化因子，緩解肝臟炎癥，阻斷NF-κB通路可抑制炎癥反應(yīng)；LBP可通過(guò)抑制血清中炎性介質(zhì)IL-6、IL-1、TNF-α表達(dá)，減輕腦缺血導(dǎo)致的腦病理組織損傷及神經(jīng)功能障礙〔32〕；有研究報(bào)道，AP患者血漿中LPO、MPO含量升高，SOD活性降低〔33〕；韓麗娜等〔34〕研究揭示LBP保護(hù)AP小鼠胰腺損傷的作用機(jī)制。

綜上，LBP可保護(hù)AP小鼠胰腺損傷，其機(jī)制可能與抗炎、抗氧化應(yīng)激有關(guān)，將為L(zhǎng)BP用于胰腺炎的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。