1,8-桉葉素改善神經(jīng)病理性疼痛大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及T淋巴細(xì)胞亞群水平

胡焓 馮丹 李少軍

(武漢市第一醫(yī)院疼痛科，湖北 武漢 430022)

神經(jīng)病理性疼痛(NP)是臨床常見(jiàn)的慢性疼痛綜合征，其發(fā)病率約占慢性疼痛中人數(shù)的三成以上，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響〔1〕。當(dāng)前，臨床中尚缺乏理想治療NP的藥物，部分藥物具有一定毒副作用或成癮性，因此尋找有效治療藥物十分迫切〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)〔3,4〕，NP的發(fā)生、發(fā)展與中樞神經(jīng)遞質(zhì)、機(jī)體免疫狀況關(guān)系密切。天然1,8-桉葉素廣泛存在于植物精油單體中，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、平喘等多種作用，關(guān)于其減輕NP疼痛的作用已在動(dòng)物試驗(yàn)中證實(shí)〔5〕，但關(guān)于1,8-桉葉素在NP發(fā)生中的具體作用的研究尚少。本研究觀察1,8-桉葉素對(duì)NP大鼠神經(jīng)源性疼痛的影響，重點(diǎn)觀察對(duì)外周血神經(jīng)遞質(zhì)及T淋巴細(xì)胞亞群水平的影響，以期為闡明NP發(fā)病機(jī)制及1,8-桉葉素應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 1,8-桉葉素(美國(guó)Regal公司，純度≥98.0%)，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NA)、5-羥色胺(HT)試劑盒(上海生物工程技術(shù)公司)，白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(R&D公司)；Von Frey電子痛閾測(cè)量?jī)x(上海玉研儀器)，CytoFLEX流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER公司)，3550UV酶標(biāo)儀(Bio-rad公司)。SPF級(jí)雄性SD大鼠，50只，8周齡，體重(200±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0009。

1.2NP模型建立 取50只大鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組、NP組、假手術(shù)(Sham)組，按10 ml/kg腹腔注射0.3 %戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，左后肢剃毛消毒備皮，股骨大轉(zhuǎn)子與膝關(guān)節(jié)之間沿臀大肌做1 cm切口，頓性分離暴露坐骨神經(jīng)，玻璃分針?lè)蛛x脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分支，并用棉線扎緊后剪斷遠(yuǎn)心端(Sham組系活結(jié)、不剪斷)，保留腓腸神經(jīng)，分層縫合切口。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，保持通風(fēng)和墊料干燥。術(shù)后7～9 d連續(xù)3 d采用Von Frey痛閾測(cè)量?jī)x檢測(cè)5組大鼠左后足縮足反射機(jī)械刺激閾值(MWT)：實(shí)驗(yàn)前安靜環(huán)境適應(yīng)20 min，刺激針垂直刺激大鼠左后足，記錄使其產(chǎn)生抬足反射的最小刺激強(qiáng)度即為縮足MWT，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(間隔5 min)，取最小值即為MWT，除Sham組外，取MWT<4 g大鼠參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3MWT檢測(cè) 取MWT<4 g大鼠，立即開(kāi)始干預(yù)給藥，低、中、高劑量組分別灌胃50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 1,8-桉葉素，NP組、Sham組分別灌胃等量生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d，給藥1 d、3 d、7 d后再次檢測(cè)左后足MWT值(參見(jiàn)方法1.2中檢測(cè)MWT方法)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(間隔5 min)，取最小值。

1.4血清神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測(cè) 給藥7 d上午10∶00點(diǎn)，左股動(dòng)脈取血4 ml，立即置于預(yù)冷離心機(jī)(4℃)2 000 r/min離心10 min后，轉(zhuǎn)移上清液至離心管中，采用FR510熒光分光光度計(jì)以化學(xué)熒光法檢測(cè)血清中DA、NA、5-HT含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求操作。

1.5T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 給藥7 d后取股動(dòng)脈血4 ml，加入250 U肝素，制備抗凝血。取200 μl抗凝血滴加抗大鼠T淋巴細(xì)胞亞群雙標(biāo)抗體各20 μl〔抗CD3+-異硫氰酸熒光素(FITC)/抗CD19-藻紅蛋白(PE)、抗CD3+-FITC/抗CD8+-熒光單克隆抗體(PerCP-Cy5.5)/抗CD4+-別藻藍(lán)蛋白(APC-H7)〕，混勻后避光孵育15 min，然后加入3 ml溶血?jiǎng)玖暇彌_液重懸，按照試劑盒說(shuō)明書操作要求，采用流式細(xì)胞儀分析T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+陽(yáng)性細(xì)胞率，計(jì)算CD4+/CD8+。

1.6血清細(xì)胞因子IL-2、TNF-α水平檢測(cè) 給藥7 d后取股動(dòng)脈血2 ml，室溫靜置分層后，2 800 r/min、12 min，取上層血清，采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-2、TNF-α含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況 50只大鼠建模后共45只參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)，Sham組、NP組、低、中、高劑量組分別有10、9、8、9、9只大鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)；建模期間NP組和低劑量組分別有1只大鼠MWT>4 g剔除實(shí)驗(yàn)，低、中、高劑量組分別有1只術(shù)后24 h內(nèi)死亡，剔除實(shí)驗(yàn)。

2.2大鼠MWT值對(duì)比 MWT值組間、時(shí)間、交互比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=35.115、F時(shí)間=19.100、F交互=23.127；均P=0.000)。給藥前Sham組MWT值顯著高于NP組及低、中、高劑量組(P<0.05)，NP組、低、中、高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥后各組MWT值比較從高至低依次如下：Sham組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、NP組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低、中、高劑量組MWT值隨時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著升高趨勢(shì)(P<0.05)，NP組隨時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著降低趨勢(shì)(P<0.05)，Sham組隨時(shí)間延長(zhǎng)變化不顯著(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組給藥不同時(shí)間縮足MWT值對(duì)比

2.3血清神經(jīng)遞質(zhì)水平對(duì)比 給藥7 d后各組血清神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT水平比較從高至低依次為：NP組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、Sham組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 血清神經(jīng)遞質(zhì)水平對(duì)比

2.4外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化 對(duì)比給藥7 d后各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+，從高至低依次為：Sham組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、NP組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD8+比較從高至低依次為：NP組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、Sham組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表3。

圖1 CD3+、CD4+、CD8+流式細(xì)胞檢測(cè)

2.5血清細(xì)胞因子IL-2、TNF-α水平對(duì)比 給藥7 d后各組血清細(xì)胞因子IL-2水平比較從高至低依次為：Sham組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、NP組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNF-α水平由高至低依次為NP組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、Sham組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化及血清細(xì)胞因子IL-1、TNF-α水平對(duì)比

3 討 論

NP臨床主要表現(xiàn)為自發(fā)性持續(xù)疼痛和痛覺(jué)過(guò)敏〔6〕。導(dǎo)致NP發(fā)病的原因較多，如外傷、外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤壓迫等多種因素均可誘發(fā)NP〔7〕。生理狀態(tài)下，機(jī)體接收痛覺(jué)刺激信號(hào)后，外周感覺(jué)神經(jīng)元感受器興奮，興奮信號(hào)經(jīng)初級(jí)神經(jīng)元、初級(jí)中樞，最終傳導(dǎo)至丘腦或皮層中樞系統(tǒng)，痛覺(jué)反應(yīng)發(fā)生。NP病理狀態(tài)下，外周神經(jīng)元接收疼痛刺激信號(hào)后，其感受器激活閾值處于較低水平，微小刺激即可引發(fā)興奮，繼而發(fā)生外周敏化〔8〕。

本研究結(jié)果提示1,8-桉葉素可顯著減輕NP大鼠神經(jīng)源性疼痛，其中200 mg/kg效果最佳，可能與抑制體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)。NE、DA、5-HT均屬于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，作為神經(jīng)介質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可起鎮(zhèn)痛效應(yīng)，而在外周神經(jīng)系統(tǒng)中主要作為致痛因子發(fā)揮調(diào)節(jié)疼痛效應(yīng)〔9，10〕。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)可通過(guò)Ca+或環(huán)核苷酸對(duì)機(jī)體局部作用，繼而刺激感覺(jué)神經(jīng)末梢發(fā)揮致痛作用〔11〕。DA在外周血中累積濃度過(guò)高，可導(dǎo)致DA能系統(tǒng)功能激活，繼而引起痛覺(jué)過(guò)敏〔12〕。5-HT與疼痛關(guān)系密切，5-HT可從崩解血小板中釋放入血，顯著提高傷害性感受器對(duì)緩激肽敏感性，疼痛過(guò)敏〔13〕。本研究NP模型組大鼠機(jī)械痛閾較Sham組明顯較低，而應(yīng)用不同劑量1,8-桉葉素干預(yù)后，大鼠機(jī)械痛閾水平明顯升高，且血清單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平不同程度降低，推測(cè)1,8-桉葉素可抑制NP大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放，緩解疼痛，參與NP疾病發(fā)展。

本研究結(jié)果提示1,8-桉葉素對(duì)NP大鼠神經(jīng)源性疼痛減輕作用可能與調(diào)整T細(xì)胞亞群失衡、改善機(jī)體免疫功能有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)〔14〕，外周神經(jīng)損傷與機(jī)體免疫力關(guān)系緊密，NP患者普遍存在免疫調(diào)節(jié)紊亂，主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞亞群功能失衡及其細(xì)胞因子表達(dá)失調(diào)。CD4+為輔助性T細(xì)胞亞群，可通過(guò)分泌細(xì)胞因子、輔助自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞共同增強(qiáng)免疫應(yīng)答過(guò)程，CD8+是抑制性T細(xì)胞亞群，可抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷功能，生理狀態(tài)下CD4+與CD8+相互平衡和制約，共同維持機(jī)體免疫功能〔15，16〕。本研究應(yīng)用不同劑量1,8-桉葉素干預(yù)后，NP大鼠CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞亞群占比顯著提高，且CD4+/CD8+比值升高，說(shuō)明1,8-桉葉素可調(diào)節(jié)NP免疫失衡狀態(tài)，有助于疼痛的緩解。本研究中應(yīng)用1,8-桉葉素干預(yù)后，與未實(shí)施干預(yù)的NP大鼠比較，IL-2水平上調(diào)，輔助增強(qiáng)特異性免疫反應(yīng)，TNF-α水平下調(diào)，外周神經(jīng)損傷炎癥反應(yīng)被抑制，產(chǎn)生的痛覺(jué)過(guò)敏緩解。由此，1,8-桉葉素可能通過(guò)調(diào)整T細(xì)胞亞群失衡、改善機(jī)體免疫功能緩解NP大鼠神經(jīng)源性疼痛。

綜上所述，1,8-桉葉素可顯著減輕NP大鼠神經(jīng)源性疼痛，其中200 mg/kg效果最佳，可能與抑制體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放、調(diào)整T細(xì)胞亞群失衡、改善機(jī)體免疫功能有關(guān)。1,8-桉葉素可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能治療NP，為臨床中應(yīng)用1,8-桉葉素治療NP提供參考依據(jù)，但其具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。