外源性CGRP對ALI大鼠肺組織AQP1及p-JNK表達的影響

唐書福 趙建軍 張建勇 肖雯雯 張紅

(遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科呼吸二病區，貴州 遵義 563000)

急性肺損傷(ALI)或其更加嚴重的階段急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由多種因素(包括肺內和肺外直接或間接病因等)導致的，肺的組織病理學主要為血管內皮細胞和肺泡上皮細胞受到損傷引起的非心源性肺水腫〔1，2〕。ALI/ARDS起病急、進展快，死亡率高達30%～50%〔3，4〕。研究發現，炎癥反應機制是ALI重要致病機制，而水通道蛋白(AQPs)與ALI肺水腫的發生和發展的關系密切〔5〕。另有研究報道，內毒素對AQPs的調控作用主要通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中的c-Jun氨基端蛋白激酶(JNK)和細胞外信號調節激酶(ERK)兩條途徑完成〔6〕。降鈣素基因相關肽(CGRP)作為具有抗炎作用的一種新型抗炎介質，文獻報道其具有減輕ALI肺水腫的作用。在ALI肺水腫中AQP1與JNK信號傳導間的關系尚未完全明確。本研究旨在探討靜脈注射藥物CGRP對ALI大鼠肺組織AQP1及磷酸化(P)-JNK表達的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 本實驗動物SD雄性大鼠(n=42，體重178～225 g)購于第三軍醫大學動物實驗中心。將42只大鼠隨機分為NS對照組(NS組，n=7)、CGRP對照組(CGRP組，n=7)、急性肺損傷組(ALI組，n=14)和干預組(Control組，n=14)共四個大組，其中ALI組分為6 h ALI組和12 h ALI組兩個亞組(各亞組n=7)，Control組分為6 h Control和12 h Control組兩個亞組(各亞組n=7)。

1.2主要實驗試劑及實驗藥物 本實驗中主要試劑脂多糖(LPS)、CGRP試劑和小鼠AQP1單克隆抗體分別購于Sigma、Tocris和abcam公司，p-JNK1/2多克隆抗體、GAPDH于美國Affinity公司購買。

1.3構建實驗模型 本研究中按LPS以10 mg/kg以尾靜脈注射建立ALI組大鼠模型，分別在6 h和12 h取標本；Control組按5 μg/kg尾靜脈注射藥物CGRP，成功注射CGRP后1 h按10 mg/kg尾靜脈注射LPS，分別于6 h和12 h取材；CGRP組按5 μg/kg尾靜脈注CGRP后6 h取標本；NS組按0.2 ml(1 ml/kg)尾靜脈注射NS后6 h取標本。

1.4指標檢測

1.4.1肺泡灌洗液(BALF)細胞計數 收集各組SD大鼠的BALF，取10 μl的標本滴在細胞計數板上，光鏡下計數細胞數；取離心后的BALF沉淀20 μl涂片(2～3張/標本)，待晾干玻片后進行姬姆薩染色，在油鏡下(單盲法)計數 200個細胞，計算出細胞數。

1.4.2肺組織濕/干重比值(W/D) 取各組大鼠右上葉肺標本，用濾紙將其表面血液和水分吸干盡，電子天平稱肺組織重量，計為濕重(W)；后將其置于80℃烤箱中烘烤48 h后稱肺組織重量，計為干重(D)，計算出各組大鼠肺組織標本W/D值。

1.4.3免疫組化(IHC)法測定各組大鼠肺組織AQP1和p-JNK蛋白表達水平 本實驗按IHC試劑盒說明，采用IHC方法(二步法)，觀察AQP1和p-JNK蛋白表達。各組肺組織石蠟切片標本脫蠟、脫水后，熱修復抗原，山羊血清封閉非特異性抗原，依次滴加入一抗、二抗和卵白素-生物素-酶復合物(ABC)復合物，然后使用二氨基聯苯胺(DAB)顯色后進行脫水和中性樹膠封片等處理。用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗設為空白對照，呈現棕黃色的顆粒者為陽性。

1.4.4Western印跡檢測AQP1和p-JNK蛋白水平 稱量20 mg的各組大鼠肺組織標本后用組織細胞快速放射免疫沉淀(RIPA)裂解液勻漿，在離心機(溫度為4℃、轉速12 000 r/min)下離心10 min，取上清液測樣本蛋白濃度。取25 μg蛋白上樣于制備好的凝膠中的每個孔上進行電泳、轉膜和封閉處理后稀釋一抗(濃度1∶1 000)，環境溫度4℃下孵育過夜后次日加入辣根過氧化物酶標記二抗(稀釋比例1∶10 000)中，37℃孵箱中孵育1 h后經增強型化學發光試劑處理。暗室中曝光膠片，并做好標記后掃描圖片存儲備用。AQP1和p-JNK表達量分別用AQP1陽性著色面積(IOD值)/內參GAPDH陽性著色面積(IOD值)和p-JNK陽性著色面積(IOD值)/內參GAPDH陽性著色面積(IOD值)來計算。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析，LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組BALF中細胞數及分類所占比 在6 h ALI組、6 h Control組、12 h ALI 組和12 h Control組BALF中白細胞數目及中性粒細胞所占比較NS組明顯增多，以12 h ALI組最多，差異有統計學意義(均P<0.01)；6 h Control組、12 h ALI組BALF中白細胞數目及中性粒細胞所占比明顯小于6 h ALI組(均P<0.01)，12 h Control組BALF中白細胞數目及中性粒細胞所占比明顯小于12 h ALI組(均P<0.01)。見表1。

表1 各組BALF中細胞數及分類所占比

2.2各組肺組織W/D值 在6 h ALI組(6.19±0.61)、12 h ALI組(7.52±0.42)、6 h Control組(5.58±0.29)和12 h Control組肺組織W/D值(6.03±0.16)較NS組(4.04±0.37)明顯增大(均P<0.01)，以12 h ALI組最大。6 h Control組肺組織中W/D值較6 h ALI組明顯減小(P<0.01)。12 h Control組W/D值較12 h ALI組明顯減小(P<0.01)。

2.3IHC法測定大鼠AQP1和p-JNK蛋白表達水平 AQP1主要在血管內皮細胞核和細胞質中表達，部分肺泡上皮及小氣道上皮細胞核和胞質中有少量表達。6 h和12 h ALI、Control組肺組織中AQP1表達水平明均較NS組明顯減少(P<0.05)；6 h ALI組較6 h Control組、12 h ALI組較12 h Control組大鼠肺組織中AQP1蛋白表達量均明顯減少(均P<0.05)。見表2、圖1。

表2 IHC法測得各組大鼠肺組織AQP1、p-JNK蛋白表達水平

圖1 IHC法各組肺組織 AQP1的表達(×20)

p-JNK IHC結果顯示：其陽性細胞在小氣道上皮、肺泡上皮和血管內皮的細胞核和胞質中少量表達；與NS組比較，6 h ALI組、6 h Control組、12 h ALI 組和12 h Control組p-JNK表達顯著增多，其廣泛表達于氣道和肺泡的上皮細胞，血管內皮細胞及間質細胞當中。6 h Control組和12 h Control組陽性細胞較NS組和CGRP組明顯增多(P<0.05)；6 h Control組和12 h Control組大鼠肺組織中p-JNK表達較相同時段的ALI組明顯增多(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 IHC 法各組肺組織p-JNK的表達(×20)

2.4Western印跡測各組大鼠肺組織AQP1和p-JNK表達 6 h ALI組、12 h ALI組、6 h Control組、12 h Control組AQP1表達明顯低于NS組(P<0.05)，p-JNK表達明顯高于NS組(P<0.05)；與6 h ALI組比較，6 h Control組AQP1表達量均明顯增加，p-JNK表達明顯減少(均P<0.05)；12 h Control組AQP1表達明顯高于12 h ALI組，p-JNK表達明顯低于12 h ALI組(均P<0.05)。見圖3、表3。

1～6：NS組、CGRP對照組、6 h ALI組、6 h Control組、12 h ALI組、12 h Control組圖3 Western印跡測各組大鼠肺組織AQP1和p-JNK的蛋白表達

表3 Western印跡測得各組大鼠肺組織AQP1、p-JNK的表達量

3 討 論

ALI/ARDS是由多種因素如重癥感染、休克和中毒等造成全身炎癥反應綜合征，組織病理改變主要為肺泡上皮和血管內皮受損致其通透性增加而導致肺泡和間質的水腫，其主要表現為逐漸加重的呼吸困難和難以糾正的低氧血癥。肺部X線或肺部CT檢查主要表現為雙肺浸潤性或滲出性改變〔7,8〕。ALI/ARDS是內科的常見急危重癥，其起病急驟、進展快，常可致多臟器功能受損而導致死亡率高。

炎癥反應機制為ALI/ARDS主要致病機制之一。炎癥反應過度失控是其致病的核心環節，炎癥反應失控進一步加重肺泡上皮及血管內皮的損傷，使血管內皮通透性增加，Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷，表面活性物質生成減少，導致肺表面張力增大與順應性降低，肺泡塌陷和有效通氣面積減少，因此出現呼吸窘迫、難以糾正的低氧血癥的表現。由于肺與全身血液及淋巴循環相通，肺是膿毒癥最早受累的臟器。研究表明，革蘭陰性桿菌感染〔9,10〕是最容易導致膿毒癥，而膿毒癥是導致ALI最常見因素之一〔11〕。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，在膿毒癥的致病機制中扮演著重要角色〔12〕。在構建ALI的模型時，因干預藥物及干預方式的不同，ALI模型的嚴重程度亦有所不同。本實驗在肺組織學改變中，病理改變以毛細血管充血、肺泡及間質中大量炎性細胞浸潤為主，同時見肺泡腔內紅細胞滲出及肺泡間隔增寬和紊亂，從另一角度說明本實驗中，通過尾靜脈注射LPS建議大鼠的ALI模型亦是成功的。在本研究不足之處在于，BALF中中細胞計數及分類計數偏少，與相關文獻報道之間存在一定差異〔13〕，分析其原因可能為尾靜脈注射所致的ALI模型中血管內皮損傷早，而肺泡和大氣道內活化多形核白細胞遷移晚，而非直接氣管內滴入導致的ALI模型中的多形細胞計數明顯。

ALI/ARDS時主因肺泡液清除功能下降導致了肺水腫發生和發展。研究發現，AQP1分子量約29 kD，主要分布于肺毛細血管內皮，對肺組織水分的平衡和新生血管的生成等功能的調節以及維持機體正常的呼吸功能具有重要的意義〔14〕。AQP1數量多少或者功能的改變對肺泡內液的形成和祛除具有重要的意義〔15〕。本研究結果提示過多肺泡內液聚集于肺組織內，AQP1參與了ALI時肺水腫的病理生理進程。研究發現，MAPK信號通路是參與ALI時調控炎癥反應的重要通路之一，而AQPs的改變亦受到MAPK信號通路所調控。MAPK信號傳導通路家族中JNK信號通路在ALI/ARDS的致病過程中發揮著至關重要的作用。本研究結果說明LPS可致使炎癥因子釋放增多，進一步激活p-JNK，導致炎癥級聯式放大效應，進一步推動ALI發生與發展的病理進程。

新發現的抗炎性介質CGRP，其在ALI的致病過程中具有重要的抗炎的生物效應。黃亮等〔16〕研究發現，CGRP干預可上調腦死亡大鼠中的肺組織AQP1表達水平，降低肺水含量而發揮減輕肺水腫的作用。CGRP除了具有擴張血管、減輕肺水腫的作用以外，尚具有抗炎這一生物學效應。本研究說明外源性CGRP可減輕ALI時肺內的炎性反應，提高AQP1的表達而達到減輕肺水腫的作用。同時間點的干預組大鼠肺組織p-JNK量比ALI組有減少，與陳龍等〔17,18〕的研究報道較為吻合，提示靜脈注射CGRP可抑制炎性介質的釋放，致p-JNK失活，阻斷JNK信號通路以減輕ALI時肺臟的炎癥反應和肺水腫程度而達到保護肺的作用。

綜上，炎癥反應機制是ALI重要的致病機制，而MAPK信號通路參與與炎性反應進程。研究表明MAPK信號通路激活后，促進了炎癥級聯放大效應，加速了ALI發生和發展的病理進程。CGRP作為新型炎癥消退介質，其靜脈注射可抑制炎癥因子如TNF-α、IL-1β等的釋放，引起p-JNK活化受阻并且阻斷JNK信號通路的傳導，促進ALI大鼠肺組織AQP1的表達，產生減輕ALI/ARDS時肺內炎癥反應和肺水腫的生物學功能。目前，對CGRP干預可以減輕ALI所致肺內炎癥和肺水腫的機制研究中，AQP1的表達水平是直接提高或是通過JNK信號通路間接因素上調AQP1的表達尚未完全明確，有待進一步研究闡明。