瑤藥滿山香總黃酮提取工藝的優化

唐春麗　魏江存　陸梅元　謝臻　陳宏夏　趙鳳仙

摘要：采用回流提取法提取滿山香（Schisandra propinqua）總黃酮，通過單因素試驗，考察提取方法、提取溶劑體積分數、提取液體積、提取時間對藥材總黃酮含量的影響，采用正交試驗，優化提取工藝條件，篩選出滿山香總黃酮的最佳提取工藝。結果表明，滿山香總黃酮的最佳提取工藝為60%乙醇、料液比1：40（m： V）、回流提取時間1.0 h。該方法能有效測定滿山香藥材總黃酮的含量，重復性較好、穩定可行。

關鍵詞：滿山香（Schisandra propinqua ）;總黃酮;提取工藝

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114 （2020） 16-0126-04

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.028

滿山香來源于木蘭科植物合蕊五味子[Schisandrapropinqua （WaII.） Baill. var. iutermdida A. C. Smith]的干燥藤莖和根，為廣西常用藥材，具有舒筋活血、消腫止痛的功能，用于治療骨折、慢性胃腸炎、風濕性關節炎、痛經、外傷出血等病癥[1，2]。以滿山香為主要原料的燈銀腦通膠囊用于中風中經絡、瘀血阻絡的治療。目前，野生滿山香植物資源種群稀少，蘊藏量小[3];瑤藥滿山香含有木脂素類[4-6]、黃酮類[7，8]、揮發性[1]等成分。黃酮類化合物是廣譜生物活性物質，普遍存在于植物中，具有抗癌、防癌、抑菌、抗病毒、降低膽固醇等藥理作用與生物活性，以及對內分泌系統[9]和免疫系統等有很好的保護作用[10-13]。

本研究以瑤藥滿山香總黃酮含量為指標，采用單因素試驗考察了提取方法、提取溶劑體積分數、提取液體積、提取時間對提取滿山香藥材總黃酮含量的影響，并采用正交試驗進一步優選最佳提取工藝，為進一步研究滿山香藥材的質量標準提供了一定的參考依據。目前，國內對滿山香藥材總黃酮含量測定的相關研究鮮見報道，為保證其藥材質量及臨床療效，本試驗建立滿山香總黃酮的含量測定方法，為后期開發、利用其藥用資源提供科學依據。

1材料與方法

1.1儀器

UV1780型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）;XS105D型十萬分之一天平（梅特勒-托利多稱重設備系統有限公司）;KQ5200B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;數顯電子恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）;優普ULUPURE實驗室超純水儀（上海優普實業有限公司）。

1.2 材料

蘆丁，純度>98%，購于上海融禾醫藥科技有限公司;甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等所用試劑均為分析純。藥材采摘于廣西賀州市富川瑤族自治縣，經廣西中醫藥大學藥學院陳勇教授鑒定為木蘭科植物合蕊五味子，經52 ℃烘干，備用。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥到恒重的蘆丁對照品適量，加60%乙醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.4482 mg/mL的對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取瑤藥滿山香藥材粉末1.0 g，置于100 mL的錐形瓶中，加入25 mL體積分數為60%的乙醇，稱定其重量，水浴回流提取1.0 h，再稱定重量，使用60%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液2.0 mL，置于50 mL容量瓶中，依據總黃酮的測定方法測定其吸光度，用線性方程求出樣品溶液中總黃酮的含量，計算得到滿山香藥材總黃酮含量。

1.3.3 檢測波長的選擇 精密量取上述對照品溶液3 mL于25 mL容量瓶中，再加入1mL的5%亞硝酸鈉溶液，輕輕搖勻，靜置6 min后加入1 mL的10%硝酸招溶液，搖勻，靜置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置12 min，以相應試劑作空白，采用分光光度法在400～800 nm測定吸收光譜，其最大吸收波長為512 nm。

1.3.4 標準曲線的繪制 分別取“ 1.3.1”的對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL 于 25 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸納0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸鉛0.4 mL，放置6 min，再加4%的氫氧化鈉4mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在512 nm測定[18]。

1.3.5 單因素試驗

1） 提取方法。取滿山香藥材粉末1.Og，精密稱定，置于錐形瓶中，提取時間1 h、25 mL、60%乙醇為提取條件，分別采用超聲提取法、回流提取法和浸漬法對藥材進行總黃酮提取，考察不同提取方法對滿山香總黃酮提取率的影響。

2） 乙醇溶劑體積分數。取藥材粉末1.Og，精密稱定，置于錐形瓶中，提取時間1.0 h、25 mL不同體積分數（30%、50%、60%、70%和85%）的乙醇溶劑為提取條件，采用回流提取法，分析乙醇溶劑不同體積分數對藥材總黃酮提取率的影響。

3） 提取時間。取藥材粉末1.Og，精密稱定，置于錐形瓶中，以60%乙醇25 mL為提取條件，采用回流提取法，分析提取時間對藥材總黃酮提取率的影響，設提取時間為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。

4） 提取液體積。取藥材粉末1.Og，精密稱定，置于錐形瓶中，提取時間1h、60%乙醇為提取條件，采用回流提取法，分析乙醇不同體積對藥材總黃酮提取率的影響，設計60%乙醇提取體積分別為20、30、40、50、60、70 mL。

以上單因素試驗按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測定。

1.3.6 正交試驗設計 從中藥滿山香中提取藥材總黃酮的方法主要為有機溶劑提取法。根據查閱的相關文獻[14-17]，本試驗最終采取不同體積分數乙醇為溶劑的提取方法，根據單因素考察結果，設置乙醇體積分數（50%、60%、70%）、料液比（1：30、1：40、1：50，m：V，下同）、提取時間（1.0、1.5、2.0 h）這3個條件。根據正交設計助手軟件，使用L9（34）正交試驗設計方法，試驗因素和水平見表1。

2結果與分析

2.1 線性方程的制定

以吸光度對蘆丁溶液濃度繪制標準曲線，線性方程為y=13.042x-0.038 5，R2=0.999 1，在0.008964～?0.071712 mg/mL濃度與吸光度有良好的線性關系。

2.2方法學考察

2.2.1 精密度試驗 精密稱取滿山香藥材粉末1.0g，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測定。于512 nm波長下連續6次測定其吸光度，結果為1.06%，小于3.00%，表明該方法精密度良好。

2.2.2 穩定性試驗 取滿山香藥材粉末1.0 g，精密稱定，按照“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3的方法顯色測定，測定同一供試液在不同時間下的吸光度，于512 nm波長處分別在0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度，計算藥材的RSD值為2.41%，小于3.00%，吸收度在60 min內基本不變，表明樣品在60 min內基本穩定。

2.2.3 重復性試驗 精密稱取瑤藥滿山香藥材粉末樣品6份，每份約1.0 g，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測定。于512 nm波長處平行測定其吸光度，計算滿山香藥材總黃酮的平均含量為 22.78 mg/g，RSD 值為 2.79%，小于 3.00%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗 取同一批次已知總黃酮含量的滿山香藥材粉末（含量為22.78 mg/g）0.5 g，精密稱定，共9份，分成3組，即低、中、高加樣組（0.5 g藥材總黃酮含量的80%、100%和120%加樣，精密加入蘆丁對照品，加樣量分別為9.20、11.40、13.65mg），按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測定。于512 nm波長處平行測定其吸光度，計算總黃酮的含量。由試驗結果分析可知，滿山香藥材的低、中、高加樣組總黃酮的平均回收率分別為 98.78%、100.56%、99.40%，RSD分別為 2.59%、2.04%、2.93% （n=3），表明該方法準確性良好，結果見表2。

2.3單因素試驗結果

由圖1可知，不同提取方法對滿山香總黃酮提取率的影響中，回流提取法的提取率最高，故而選擇回流提取進行后續試驗。由圖2可知，60%乙醇回流提取滿山香葉總黃酮的提取率最高。不同提取時間對滿山香總黃酮提取率的影響結果（圖3）表明，提取時間為1.5 h時，總黃酮提取率最高。由圖4可知，結果顯示提取液體積為40 mL時，滿山香總黃酮提取率最高。

2.4 正交試驗結果與分析

2.4.1 正交試驗結果 根據正交設計助手軟件、正父試驗結果（表3）和方差分析結果（表4）可知，以瑤藥滿山香總黃酮的含量為試驗指標，由于各試驗因素對滿山香藥材總黃酮提取效果的影響程度不同，乙醇體積分數和料液比對滿山香總黃酮的提取工藝有顯著影響，而提取時間對滿山香總黃酮的提取工藝無顯著影響，且各影響因素的大小順序為料液比（5）>乙醇體積分數（4）>提取時間（C），考慮試驗的效率、時間以及成本，故而選擇提取時間為l.Oh，因此，本試驗最理想的提取方案是，即乙醇體積分數是60%，料液比是1：40，回流提取時間是1.0 h，此時提取效果最佳。2.4.2驗證試驗精密稱取滿山香藥材粉末3份，每份約1.0 g，置于錐形瓶中，測定其總黃酮含量，結果（表5）表明，采用正交試驗優化的工藝提取滿山香藥材總黃酮，其含量平均值為23.53 mg/g，/^D為1.94%〇

3小結與討論

本試驗以滿山香藥材為研究對象，考察了乙醇體積分數、提取液體積和提取時間3個影響因素，瑤藥滿山香總黃酮的提取采用回流提取法，利用正交試驗的方法優化瑤藥滿山香總黃酮的最佳提取工藝。前期研究發現，影響瑤藥滿山香總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑體積分數、提取液體積和提取時間，根據試驗影響因素的選擇與確定，本試驗采用L9（34）正交試驗設計的方法，進行多次試驗，結果分析表明，瑤藥滿山香的最佳提取工藝，即采用回流提取法，乙醇體積分數為60%，料液比為1：40，提取時間為1.0 h，此時瑤藥滿山香總黃酮提取效果最佳。

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗，建立了滿山香總黃酮提取率的工藝優化。方差分析表明，乙醇體積分數、料液比2個因子具有顯著性，各因子對總黃酮含量影響的大小依次為料液比（B）>乙醇體積分數（A）>提取時間（C）。

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收稿日期：2019-11-15

基金項目：國家自然科學基金項目（81360524） ;2019年度廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目（2019KY0341）;廣西中醫藥大學青年基金項目（2019QN036）;廣西然科學基金項目（2014GXNSFAA118208）;國家中醫藥管理局科研三級實驗室中（壯）藥化學與質量分析實驗室（國中醫藥發2009[21]號）

作者簡介：唐春麗（1980-），女，廣西桂平人，副主任藥師，碩士，主要從事中藥質量分析及其藥效機制研究，（電話）18978913964（電子信箱）12072982891@qq.com;通信作者，魏江存，藥師，碩士，主要從事中藥、民族藥及其制劑質量分析和藥效機制研究，（電子信箱）960837714@qq.com。