鴨疫里默氏桿菌和副粘病毒混合感染的診斷

羅玲　李麗　汪宏才　溫國元　羅青平　王紅琳　盧琴　商雨　邵華斌　王孝忠

摘要：2019年7月，湖北省某養殖場飼養的10 000只鴨暴發疫病，引起大量死亡，經實驗室細菌學診斷和病毒學診斷，確診為鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）和副粘病毒混合感染。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）;副粘病毒;混合感染;診斷

中圖分類號：S855.3 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020） 16-0115-03

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.025

鴨疫里默氏桿菌病是危害全世界養鴨業一種重要的水禽細菌性疾病，是由鴨疫里默氏桿菌（Rieme-rella anatipestifer）引起家鴨、火雞、鵝和其他禽類的一種接觸性傳染病，又名鴨傳染性漿膜炎。該病呈急性或慢性敗血癥形式，其特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪性輸卵管炎等，發病率和死亡率很高，易產生耐藥性，且血清型眾多，給該病的防治工作帶來很大困難，已對養鴨業造成了巨大的經濟損失[1]。鴨副粘病毒病是危害全世界養鴨業的一種重要病毒病，沒有明顯的流行季節，發病后病鴨并非立即死亡，而是混合或繼發感染其他病毒病或細菌病，使鴨群的病情加重，造成重大的經濟損失。近年來，養殖場病毒病混合或繼發感染細菌病已成普遍現象，增加了疾病診斷和防控難度。

2019年7月，湖北省某養殖場飼養的10000只麻鴨暴發疫病，引起大量死亡，發病后經實驗室診斷，確診為鴨疫里默氏桿菌和副粘病毒混合感染，經治療病情得到了控制。現將病鴨群的疾病診斷及防治情況報道如下。

1發病情況

該養殖戶為個體養殖戶，共飼養10000只地方麻鴨，圈養，2019年7月初鴨群突然發病，發病時鴨只25日齡，發病后立即投喂氟苯尼考和阿莫西林等藥物后無明顯效果，每天死亡200多只。

2 臨床癥狀

發病鴨群精神萎靡，食欲下降或不食，共濟失調，糞便呈水樣，泄殖腔周圍被糞便污染，部分病鴨出現頭頸歪斜等神經癥狀，部分鴨出現張口呼吸、甩頭等呼吸道癥狀。

3病理剖檢

送檢鴨主要剖檢病變是心包和肝臟表面均覆蓋一層灰白色的纖維素膜，氣囊有纖維素滲出性炎癥，腎臟腫大并有尿酸鹽沉積，部分鴨腺胃出血、腦出血和充血，其他組織無肉眼可見病變。

4實驗室診斷

4.1 細菌學診斷

1） 細菌分離培養。無菌采集病鴨的腦組織直接劃線接種于含5%小牛血清的TSA培養基上，置于燭缸中37 ℃培養24～48 h，挑取圓形隆起、光滑的菌落接種于含5%小牛血清的TSA、麥康凱瓊脂平板和TSB培養基，燭缸中37 ℃培養24～48 h，觀察培養結果，染色、鏡檢。

2） 生化試驗。將臨床分離菌的TSB純培養物分別接種到葡萄糖、蔗糖、棉子糖、吲哚、硫化氫、硝酸鹽、M.R、V-P、明膠液化和觸酶10種生化管進行生化試驗。

3） 藥敏試驗。選擇頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢噻吩、頭孢噻肟、阿米卡星、萘啶酸、環丙沙星、恩諾沙星、依諾沙星、左氟沙星、氟苯尼考、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿莫西林15種抗生素進行藥敏試驗，試驗方法按照世界衛生組織（WHO）推薦的Kirby-Baure法進行[2]。

4） PCR擴增鑒定。針對鴨疫里默氏桿菌camp基因設計合成引物，引物序列如下：上游引物5'-CTAGGATCCGTAAGTGGTGGGCATACA-3'，下游引物 5'-TCGAAGCTTATCTTGCAGTAGCCGTTG-3'，擴增片段長度為610 bp。PCR反應體系和反應條件按照羅玲等[3，4]方法進行。將37℃培養的臨床分離菌株進行PCR鑒定，PCR陽性產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

4.2病毒學診斷

1） 病料處理。無菌采集病鴨的肺臟和氣管等組織1g于2mL離心管中，加入含1%雙抗的PBS溶液，組織勻漿15 min，反復凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清備用。

2） 病毒分離。取上述組織上清液接種9～11日齡的雞胚，收集24 h后死亡雞胚及5 d后未死亡雞胚尿囊液。

3） 病毒RNA提取及反轉錄。取上述處理的組織上清液和雞胚尿囊液分別提取RNA，并進行反轉錄PCR。RNA提取方法按照AXYGEN Viral RNAExtraction Kit Ver. 5.0試劑盒說明書進行。反轉錄體系：反應總體積為20μL，組成如F：5×Hiscript酶5 μL，RNA 模板 8μL，H20 7μL，混勻，55℃作用 15min，85℃ 5s〇

4） 引物設計合成。參考GenBank上已發表的NDV F基因序列設計，上游引物5'-ATGGGCTC-CAGACCTTCTAC-3'，下游引物：5'-ACTGCTAGTT-GCGATAATCCG TCAG-3'，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成，片段大小為530 bp。

5） RT-PCR擴增鑒定。將獲得的cDNA進行PCR，PCR反應總體積為25μL，包括：2×Taq DNA聚合酶 12.5 μL，cDNA 2 μL，兩條 PCR 引物各 1 μL，加超純水8.5μL。反應條件為95℃預變性5 min;95 ℃變性 10 s，55℃ 退火 10 s，72 ℃ 延伸 10 s，35個循環;最后72℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，并將PCR陽性產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

5診斷結果

5.1 細菌學檢查結果

細菌分離結果：分離菌在TSA中培養24 h后，形成圓形凸起、邊緣整齊、透明、有光澤、呈奶油狀的小菌落;分離菌在TSB中培養24 h后液體渾濁;分離菌在麥康凱培養基上不生長;分離菌革蘭氏染色為陰性、短小桿菌，單個或成雙存在，少數呈鏈狀排列。