花生種子霉變機理的初步研究

楊書香　劉錦軒　江陽

摘要：根據武漢市四季溫度和濕度特征設置4個不同溫度（8、18、28、35 ℃）和空氣相對濕度（55%、75%、85%、90%），研究花生的霉變情況，計算霉變率。采用稀釋涂布平板法，對發霉的花生進行微生物分離接種，純化培養后得到2株菌株。結果表明，容易使花生種子霉變的條件為溫度28℃濕度90%，此條件下的霉變率達80.0%。通過形態觀測和顯微鏡檢測初步鑒定主要為黃曲霉菌（Aspergillus flavus）和黑曲霉菌（Aspergillus niger） 〇

關鍵詞：花生;種子霉變;黃曲霉菌（Aspergillus flavus）;黑曲霉菌（Aspergillus niger）

中圖分類號：S565.2 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114 （2020） 16-0072-04

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.014

霉變是微生物分解和吸收食物或植物上的有機營養物質后產生自身代謝產物的一種連續的生物化學過程，霉變發生過程中具有一定的階段性。在這個過程中，微生物吸收分解有機物或導致食物本身物質含量發生變化，尤其是一些敏感物質，如一些活性酶的變化就非常明顯，因此可以通過檢測食物的相關酶活性來判斷食品霉變程度，評估食品質量，制定解決方案，防止微生物的進一步污染，保證食品儲存的安全性和壽命[1]。

在人類生活的環境中存在許多霉菌，置于儲存室的農副產品也極易被霉菌感染，感染后的農副產品安全性及食用性基本喪失，給生產農戶帶來經濟損失，同時如若誤用或誤食也會造成食物中毒等嚴峻的食品安全事件。當處于適當條件時，霉菌會不斷消耗花生或其制品中的蛋白質等營養物質，代謝后會產生相應的毒素，且這些毒素都極不易被清除，人體或動物食用后會出現食物中毒甚至死亡，對健康造成很大的負面影響。花生產自于土壤中，在收獲時，土壤中的霉菌和真菌都隨著花生出土，如黃曲霉等。在儲藏期間，如若儲存環境的溫濕度把控不嚴，花生就極易發生霉變[2]。

由于花生富含蛋白質等營養物質，易被霉菌感染，最主要的霉菌是黃曲霉菌，其代謝時很容易產生黃曲霉毒素。曲霉菌屬真菌中的寄生曲霉菌和黃曲霉菌感染食物和植物后，消耗營養物質，產生代謝物質，黃曲霉毒素就是其中的一種次生代謝產物，其生長性能強，沙土、土壤、種子、果實都可以作為其生長基質，尤其是在玉米種子和花生等油料作物種子中較為常見，人和動物食用后會引起癌癥、畸形、突變等狀況。黃曲霉毒素有B1、B2、G1等十余種類型，毒性最強的屬黃曲霉素B1，如果食品與動物飼料中的黃曲霉素含量超過國家標準，被人體或者動物食用后會引起食物中毒，對人類以及動物都是一種嚴重的安全隱患[3]。

花生的儲存最重要的是要注意干燥、通風。張永輝[4]在研究中提出了花生種子儲存要點包括入庫儲存前充分晾曬（含水量降到8%左右）、室內通風、干燥防潮、消毒并保證種子干凈度、不能使用塑料密封袋儲存等。

花生耐旱喜溫，對氣候變化反應十分敏感，溫濕度、降雨量、溫度差以及日照強度的改變都會影響花生品質[5]。武漢市常年降雨量較大，且具有溫帶四季分明的典型特征，屬亞熱帶季風性濕潤氣候。年均氣溫為16℃，一年中1月平均氣溫最低，為0.4℃，7月和8月平均氣溫最高，達28.7℃，夏季正午溫度可達38℃。城區年平均相對濕度為75%～?85%，最高濕度可達95%，最低空氣相對濕度在55%左右[6]。為了探討花生的霉變機理，依據武漢市氣溫和空氣濕度特性，研究了不同溫度和空氣相對濕度條件下的花生霉變情況，以期為花生種子的生產、儲存、運輸過程提供理論依據。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 淘寶網上購買白沙果品系花生，選取飽滿、無破損、無發霉、無發芽狀況的良好種子去殼后作為試驗樣品。

1.1.2 試驗儀器 電子萬用爐（北京市永光明醫療儀器廠）JY2002電子天平（上海衡平儀器儀表廠），HPX-160B5H-III恒溫恒濕培養箱、MJ-300BS-II 霉菌培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司），LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），YXQ-SG46-280S手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），250B-J生化培養箱（金壇市鴻科儀器廠），YS100 Nikon光學顯微鏡。

1.1.3 試驗試劑 牛肉膏、蛋白胨（北京雙旋微生物培養基制品廠），氯化鈉、95%乙醇、蔗糖（天津市凱通化學試劑有限公司），瓊脂（武漢市華順生物技術有限公司），可溶性淀粉（天津市風船化學試劑科技有限公司），硝酸鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硝酸鈉、氯化鉀（天津市化學試劑三廠），磷酸氫二鉀（上海山浦化工有限公司），草酸鈉結晶紫、碘液、番紅染液、乳酸石碳酸棉藍染液等均為市售。

1.2 方法

1.2.1 培養基配制牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏0.6g，蛋白胨2g，氯化鈉1g，瓊脂0.1g，加無菌水定容至200 mL，調節pH 7.0～7.2， 121℃高壓滅菌20 min 。

高氏1號培養基：可溶性淀粉4g，硝酸鉀0.2g，氯化鈉0.1g，磷酸氫二鉀0.1g，硫酸鎂0.1g，硫酸亞鐵0.002g，瓊脂4g，加無菌水定容至200mL，調節pH 7.2～7.4，121℃高壓滅菌 20 min。

查氏培養基：硝酸鈉0.4g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鉀0.1g，硫酸鎂0.1g，硫酸亞鐵0.002g，蔗糖6g，瓊脂3g，加無菌水定容至200mL，121℃高壓滅菌20 min。

PDA培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基）：馬鈴薯40g，蔗糖4g，瓊脂3g，加無菌水定容至200mL，121℃高壓滅菌30min。馬鈴薯去皮切成塊，煮沸30 min，用紗布過濾，加糖及瓊脂，融化后補足無菌水至200 mL。

1.2.2 花生種子存放條件 根據可控條件設置溫度和濕度2個因素，其中，溫度為8、18、28、35℃共4個水平，濕度為55%、70%、85%、95%共4個水平，共16個處理，每處理重復3次，1個培養皿視為1次重復，每個培養皿放入40粒去殼的花生種子，把處理好的培養皿置于設定好的恒溫恒濕培養箱中[7]，進行3d連續霉變培養，觀察霉變情況，并拍照記錄。

1.2.3 霉變花生中菌種的分離培養 取一個250 mL的錐形瓶，加入90 mL無菌水，放入已經發生霉變的花生，置于搖床搖動30 min，使其更好地混勻，制成菌懸液備用。采用涂布平板法對樣品菌懸液中的微生物進行分離，將制備好的霉變花生原液設置為不同的濃度梯度，分別稀釋10、100、1000倍，用已滅菌的移液槍吸取1mL各濃度梯度的稀釋液加入到裝有4種培養基的無菌培養皿中，使用涂布棒將菌懸液推展開，使菌懸液均勻分布，每個濃度梯度設置3次重復。將培養基置于培養箱中培養，PDA培養基、查氏培養基和高氏1號培養基的溫度均恒定在28℃，牛肉膏蛋白胨培養基溫度恒定在37℃。每隔24 h進行觀察。

1.2.4 菌種的純化培養 待菌落在平板培養皿上生長進入旺盛期時，挑取少量孢子進行平板劃線，28℃培養后得到純化的霉菌菌落。

1.2.5 菌種的初步鑒定

1）培養特征的觀察。通過觀察霉菌菌落生長繁殖速率、菌落顏色、形態，菌絲的緊密度、性質，孢子的顏色、形態，培養基顏色變化、氣味等判別菌種[8]。

2）鏡檢。從乙醇中取出載玻片，置于火焰上灼燒后，待其冷卻，在載玻片正中央滴1滴乳酸石碳酸棉藍染液，用鑷子從霉菌菌落邊緣取少量帶有孢子的霉菌菌絲，先放入50%乙醇中浸一下洗去脫落的孢子，置于乳酸石碳酸棉藍染液中，用解剖針去除粘在菌絲根部的培養基，并將菌絲分開蓋上蓋玻片，在低倍鏡中找到物像后切換至高倍鏡下觀察。

2結果與分析

2.1 不同條件下花生霉變情況

在溫度8℃、濕度55%的處理條件下，培養3 d后霉變粒數為0粒（圖1a）;在溫度18℃、濕度70%的處理條件下，培養3d后霉變粒數為3粒，且霉變現象不明顯（圖1b）;在溫度35℃、濕度70%的處理條件下，培養3d后霉變粒數為21粒，且霉變現象較明顯（圖1c）;在溫度28 ℃、濕度70%的處理條件下，培養3d后霉變粒數為72粒（圖1d）;在溫度28℃、濕度95%的處理條件下，培養3d后霉變粒數為96粒，且霉變現象非常明顯（圖1e）。

根據公式：霉變率=霉變果粒數/檢測的總粒數×100%[8]計算霉變率。由表1可知，當溫度低于18℃，空氣濕度在70%以下時，花生未出現霉變狀況;當溫度高于18℃，空氣濕度在70%及以上時，花生有霉變現象;當溫度為28℃，濕度95%時，霉變率最局，為 80.0%。

在相同溫度條件下，濕度不同時霉變率變化情況見圖2。由圖2可以看出，溫度不變時，在設置的濕度范圍內，除8℃溫度條件下都為0以外，濕度越高，霉變率越高。

由圖3可以看出，空氣濕度不變時，除55%濕度條件下都為0以外，霉變率在8～28℃都呈不斷上升狀態，在28～35℃，霉變率開始下降，在28℃時霉變率達到峰值。

2.2 四種培養基上菌落的分布

由表2可以看出，查氏培養基9個培養基全部有菌落生長，PDA培養基有5個培養基有菌落生長，牛肉膏蛋白胨培養基和高氏1號培養基沒有菌落生長，判斷霉變花生原液中的微生物類型可能為霉菌。

2.3分離菌株的形態特征

將查氏培養基上生長狀況旺盛的菌落采用劃線平板分離法進行接種，放入培養箱中進行純化培養，每隔24h觀察1次，待菌落長勢良好后進行顯微鏡檢測。結果得到1株A菌株，菌落形態特征和顯微形態如圖4所示。由圖4可以看出，A菌落在培養基上生長繁殖速度快，顏色為黃色且帶有淡綠色，表面呈稠密的粉末顆粒狀。分生孢子為黃色，頂囊形態巨大呈橢圓形，從形態上初步判斷是黃曲霉菌（Aspergilla flavus）。培養基帶有霉味和腐臭味。

將PDA培養基上生長的菌落接種、純化培養，每隔24h觀察1次，待菌落長勢良好時進行顯微鏡檢測，結果得到1株B菌株，菌落形態特征和顯微形態如圖5所示。由圖5可以看出，B菌落在培養基上生長繁殖速度較快，培養前期為白色絮狀，蔓延性強，培養后期長出黑色孢子，呈粉末絮狀。分生孢子為黑色，頂囊形態巨大呈球形，從形態上初步判斷為黑曲霉菌（Aspergills niger）。培養基帶有霉味和腐臭味。

3小結

本研究分析了花生在日常儲存條件（不同的溫度和空氣相對濕度）下的霉變情況，并對霉變后的花生進行傳統的微生物檢測。結果顯示，當溫度高于18℃，空氣相對濕度高于70%時出現霉變現象，且在溫度28℃和濕度95%時霉變程度最明顯，霉變率達80.0%。根據霉變率可以判斷，濕度相同時，霉變率隨著溫度的上升呈先上升后下降的趨勢，在28℃時，霉變率達到了峰值;溫度相同時，霉變率隨著濕度的上升逐漸增加。微生物檢測采用傳統微生物培養方法，分離菌種后進行純化，初步判斷為黃曲霉菌和黑曲霉菌。黃曲霉菌的次級代謝產物黃曲霉素是一種具毒性的致癌物質，能引發人體與動物中毒，對人體的健康和兒童的發育帶來嚴重影響[9]。由此可見，花生的正確儲存至關重要，在日常儲存花生時應避免放在溫度高、潮濕的地方，尤其在春夏梅雨季節時要注意對儲存花生的裝置進行除濕、控溫處理，否則花生會發生霉變，食用后易對人體造成危害。

參考文獻：

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收稿日期：2019-09-02

作者簡介：楊書香（1978-），女，湖北荊州人，副教授，碩士，主要從事植物學研究，（電話）13237176800（電子信箱）54242788@qq.com;通信作者，江陽（1983-），男，講師，碩士，主要從事化學方面的教學工作。