葉酸缺乏可能誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞自噬的發(fā)生

董小歡 吳建新

隨著國內(nèi)人民生活水平的提高以及二胎政策的放開，補(bǔ)充葉酸等優(yōu)生優(yōu)育措施被越來越多的民眾所重視。葉酸是水溶性維生素B9，作為一碳單位的載體，主要參與DNA 合成和DNA甲基化這兩個重要的生物化學(xué)過程[1]。葉酸缺乏在發(fā)育異常、衰老、腫瘤等各種疾病中發(fā)揮著重要作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[2]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏可誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)發(fā)生凋亡[3]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞死亡的一種類型，但是葉酸缺乏和自噬關(guān)系尚未明確。因此，本研究選取mESCs為研究模型，探索葉酸缺乏是否可能誘發(fā)自噬。

資料與方法

1.材料：小鼠胚胎干細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存；葉酸粉末購自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(含葉酸)、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、DPBS(無鈣鎂)、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素、2-巰基乙醇、胰酶替代品均購自GIBCO公司；重組小鼠白血病抑制因子購自Millipore公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(不含葉酸)購自北京思賽因公司；明膠購自Amresco公司；哺乳動物蛋白提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；LC3和β-actin抗體均購自Cell Signal Technology公司。

2.mESCs常規(guī)培養(yǎng)和分組：胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(正常對照組,Control)包括DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖含量4 500 mg/L、葉酸含量4 mg)、15%胎牛血清、L-谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素/鏈霉素100 U/L、2-巰基乙醇0.1 mmol/L、非必需氨基酸0.1 mmol/L、丙酮酸鈉1 mmol/L、重組小鼠白血病抑制因子1 000 U/L。葉酸缺乏組(FD)完全培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基(不含葉酸)中添加葉酸2 mg，其余成分同正常對照組，且細(xì)胞培養(yǎng)條件不變。在0.2%明膠包被……