大球蓋菇多糖對大鼠運動疲勞恢復的影響*

邵 華

（西南政法大學，重慶 401100）

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata），別名皺環球蓋菇、酒紅色球蓋菇或斐氏球蓋菇，是一種珍稀的食用菌。大球蓋菇口感極佳，顏色誘人，富含多種對人體有益的礦物質、蛋白質、維生素以及多糖[1]，因此其食用價值和藥用價值是毋庸置疑的，開發潛力非常巨大。聯合國糧農組織為了扶持發展中國家的經濟發展，推薦了大批具備經濟收益的食用菌栽培品種，大球蓋菇就是其中之一[2]。大球蓋菇中的多糖成分對增強機體免疫能力有非常重要的作用，并且可有效作用于病毒、腫瘤等疾病以及消化不良、精神疲勞等方面的治療[3]。相關學者研究表明，大球蓋菇多糖的濃度決定了其對大鼠干線粒體腫脹的抑制功效[4-5]。本研究通過建立大鼠高強度運動模型，探討大球蓋菇多糖對大鼠脾臟相關細胞因子、T淋巴細胞亞群、體重及脾臟指數差異的影響，為其在運動保健過程中的作用提供一定的理論依據。

1 大球蓋菇多糖的提取過程

1.1 試劑

大球蓋菇多糖提取所需試劑主要有：95%乙醇、標準葡萄糖、標準葡聚糖、三氯甲烷、福林一酚試劑、Sephadex G-100、正丁醇、DEAE-Sephadex A-50、Sevag試劑。

1.2 儀器

大球蓋菇多糖提取所需的儀器主要有電熱恒溫水浴鍋，上海赫田科學儀器有限公司；透析袋，索萊寶科技有限公司；梯度混合儀，上海嘉鵬科技有限公司；常速離心器，普若邁德；恒流泵，天利流體工業設備廠；BS-160A型自動部分收集器，上海金鵬分析儀器有限公司；722型可見分光光度計，上海精科實業有限公司等。

2 提取以及制備方法

2.1 提取方法

將定量的大球蓋菇子實體粉末經過沉淀后在恒溫水浴鍋中提取出來，將這一過程重復操作3次，提取溫度、醇析濃度、物料比設計各不相同，將多種條件下提取出的物質離心混合上清液，濃縮成型，用丙酮和乙醇將其清洗兩次然后烘干，便形成了大球蓋菇多糖[5]。

2.2 制備方法

稱取100 g大球蓋菇子實體粉末，加入蒸餾水1 000 mL，在沸水中浸泡1 h，在4 000 r·min-1離心條件下保持15 min，提取上清液，在殘渣中加入蒸餾水500 mL，在沸水中浸泡1 h，在4 000 r·min-1離心力條件下保持15 min，提取上清液，再次提取殘渣，上清液在合并3次以后濃縮體積在250 mL，加入1 000 mL 95%乙醇靜置一夜。離心后先用80%乙醇清洗3遍，用丙酮再次清洗2遍，烘干以后便是大球蓋菇多糖樣品。

在粗多糖樣品中多次加入80 mL蒸餾水將其溶解，采用seveg法將蛋白脫離出來，做流水透析24 h，再次加入新的蒸餾水透析12 h，然后加入1 000 mL 95%乙醇沉淀出多糖，離心后將沉淀物烘干并稱重，并形成了大球蓋菇精制多糖[6]。

3 大球蓋菇多糖對運動疲勞恢復的影響研究試驗

3.1 試驗對象

試驗所需SD大鼠30只，周齡為8周，無疾病，體重差不超過20 g。這些大鼠均來自河南省實驗動物中心。大鼠進入試驗室之后飼養1周方可用于試驗，飼養溫度為26℃左右，相對濕度為45%～65%。將30只大鼠按照體重的不同平均分為3組，每組10只，分別是對照組、運動干預組、運動給藥組。

3.2 大球蓋菇多糖制備方法

試驗所用的大球蓋菇均為優質產品，統一在河南虞城縣聞集鄉金隆食用菌栽培基地購買，按照試驗要求清洗之后烘干備用。試驗的大球蓋菇多糖提取選用傳統水提法，試驗開展前期的預備試驗已經確定提取工藝，其中料液比為1∶25，溫度為90℃，共提取2次，時長為4 h，離心提取上清液，采用Sevag法脫離蛋白，離心之后獲取的大球蓋菇粗多糖加入乙醇沉淀，在真空條件下冷凍直至干燥形成大球蓋菇多糖干粉，并測定其糖含量[7]。

3.3 試劑及儀器

試驗采用的試劑主要有南京建成生物工程研究所研發的PE-CD8+、FITGCD4+、Percp-CD3+抗大鼠單克隆抗體和IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6試劑盒；由美國CST公司生產的p-p38MAPK山羊抗兔試劑盒和p-p38MAPK兔多抗試劑盒。

試驗采用的儀器主要有：FSH-2高速電動勻漿機，北京瑞麗分析儀器公司；RE-52A旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；ZH-PT動物實驗跑臺，淮北正華生物儀器設備公司；FACSCo unt流式細胞儀，美國BD公司；電泳儀及iMARK酶標儀，美國Bio-Rad公司；H2050R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發公司；Ue1Doc EZ凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司。

3.4 運動方案及給藥方案制定

3.4.1 運動方案

對照組大鼠無需進行日常運動訓練，常規喂養。運動干預組和運動給藥組大鼠均進行9周的運動訓練，每周運動6 d。大鼠在第7周要接受力竭訓練。大鼠出現呼吸急促，俯臥垂頭，跑速無法達到預期，長時間處在跑臺尾部位置，通過聲波和機械刺激無效說明大鼠力竭。

3.4.2 給藥方案

運動給藥組大鼠按照體重比例在運動開始前2 h灌胃給藥大球蓋菇多糖懸液；對照組大鼠和運動干預組大鼠則用蒸餾水替代大球蓋菇多糖懸液，為期9周的試驗每日給藥1次。

3.5 指標測定及方法

3.5.1 大鼠脾臟指數及細胞因子測定

1）脾臟指數：大鼠在接受最后1次運動訓練之后，將大鼠麻醉。為大鼠稱體重之后，將大鼠的肝臟取出稱其重量，按照公式計算出脾臟指數。

2） 細胞因子：稱重之后的大鼠脾臟研磨成粉末，加入一定量的細胞裂解液；離心之后提取細胞懸液，將其倒入24孔無菌細胞培養板中，平均每孔500 μL，放入CO2培養箱中48 h；然后離心10 min獲取上清液，將上清液冷藏于-20℃的冰箱。通過雙抗體夾心EIISA法分別測定大鼠脾臟中所含的IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6量，操作過程參照試劑盒說明書。

4 試驗結果與分析

4.1 大鼠體重及脾臟指數差異

各組大鼠體重及脾臟指數對比情況見表1。

表1 各組大鼠體重及脾臟指數對比情況Tab.1 Comparison of body weight and spleen index of rats in each group

從表1可以看出，大鼠在經過9周的跑臺運動后，對照組與運動干預組大鼠的體重及脾臟指數相比，運動干預組下降明顯；運動給藥組與運動干預組大鼠的體重及脾臟指數相比，運動干預組下降明顯。說明運動給藥組大鼠情況良好。

4.2 大鼠脾臟T淋巴細胞亞群差異

各組大鼠脾臟T淋巴細胞亞群的對比情況見表2。

表2 各組大鼠脾臟T淋巴細胞亞群的對比情況Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in spleen of rats in each group

從表2中可以看出，對照組和運動給藥組的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+相比，運動干預組降低幅度大；運動干預組和運動給藥組的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+相比，運動干預組降低幅度大。說明運動給藥組大鼠情況良好。

4.3 大鼠脾臟細胞因子差異

各組大鼠脾臟細胞因子變化情況見表3。

表3 各組大鼠脾臟細胞因子變化情況Tab.3 Changes of cytokines in spleen of rats in each group

從表3可以看出，對比3組大鼠脾臟IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6含量發現，運動干預組大鼠IL-10含量明顯降低，IFN-γ、TNF-a、IL-6含量明顯升高，表明運動干預組大鼠的運動免疫系統出現紊亂；運動給藥組大鼠在服用大球蓋菇多糖之后，與運動干預組相比IFN-γ、TNF-a、IL-6含量明顯偏低，IL-10含量明顯升高，且差異顯著，這就表示大球蓋菇多糖對高強度運動訓練大鼠的脾臟免疫系統有很好的保護作用[8]。

5 討論

脾臟是細胞免疫因子的主要聚集場所，他們控制分泌并發揮作用，可有效調節機體免疫系統，控制機體炎癥發生[9]。細胞因子作用于免疫系統時，分為兩個類別，分別是促炎因子和抗炎因子。促炎因子中主要有IFN-γ、TNF-a、IL-6等，可以增強炎性的發生，對機體的免疫系統造成損傷；抗炎因子主要有IL-4、IL-10等，可以有效抑制炎性的發生，形成對機體免疫系統的保護屏障[10]。相關研究結果顯示，長期高強度運動后機體的促炎因子更加活躍，抗炎因子受到限制，對機體免疫系統會造成損害[11]。本試驗研究表明，大球蓋菇多糖對運動大鼠脾臟促炎因子IFN-γ、TNF-a、IL-6有抑制作用，對抗炎因子IL-10有促進作用。可以有效調節和保護大鼠免疫系統的平衡。

機體免疫功能還有一個重要指標就是T淋巴細胞，長期高強度運動也會對T淋巴細胞中的CD3+、CD4+、CD8+等細胞造成影響。CD3+、CD4+、CD8+對機體產生的作用各不相同，共同維護機體免疫功能，CD4+/CD8+比值是顯示機體免疫功能是否正常運轉的指標[12]。有相關研究就高強度運動對T淋巴細胞的影響做出說明，高強度運動影響脾臟健康最終導致淋巴細胞分泌不足[13]。此次研究中運動給藥組大鼠在服用大球蓋菇多糖之后，CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8均優于運動干預組，說明大球蓋菇多糖可有效保護脾臟健康，維護T淋巴細胞分泌。

研究結果表明，大球蓋菇多糖可有效作用于高強度運動訓練大鼠的脾臟健康，調節免疫系統平衡，也就說明大球蓋菇多糖對運動疲勞恢復有積極作用。