木蹄層孔菌液體發(fā)酵工藝條件優(yōu)化*

崔馳浩，黃 亮，班立桐，孫 寧，王 玉，楊紅澎

（天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

我國真菌資源豐富，至少有10萬余種，具有藥效的超過540種，這些真菌大多為擔(dān)子菌亞門和子囊菌亞門[1]。木蹄層孔菌（Fomes fomentarius），又名火域?qū)涌拙瑢儆趽?dān)子菌綱（Basidiomycetes） 多孔菌目 （Polyporales） 多孔菌科 （Polyporaceae） 層孔菌屬（Fomes），是一種白腐菌[2]。木蹄層孔菌是生長于樺樹、楊樹、梨、蘋果等闊葉木樹干上的一種大型真菌，常在環(huán)境陰濕或光少的環(huán)境下生長，其子實體為藥用部位[3]。

木蹄層孔菌是一種具有重要應(yīng)用價值的真菌，其子實體對腫瘤細胞有很強的抑制作用，子實體和菌絲中均含有多種生物活性物質(zhì)，其中重要代表物質(zhì)為多糖[4]。中外醫(yī)藥研究成果證明，該多糖具有抗氧化、利尿、退燒、止痛、消炎、抗腫瘤等作用[4]。

液體培養(yǎng)有周期短、流動快、菌絲及其代謝產(chǎn)物較多等優(yōu)點，且從其發(fā)酵液中提取的有效成分具有保健和藥用功能[5]。合適的碳氮源及其比例、無機鹽的用量、培養(yǎng)條件對液體菌種的生長發(fā)酵有很大影響[6]，因此，選用優(yōu)良的液體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件至關(guān)重要，在液體發(fā)酵過程，營養(yǎng)菌絲在適宜的條件下生長更快，新陳代謝更加旺盛。目前關(guān)于木蹄層孔菌發(fā)酵液中多糖的研究較少。通過對培養(yǎng)木蹄層孔菌液體培養(yǎng)基的碳、氮源、初始pH、轉(zhuǎn)速、裝液量進行單因素比較試驗以及正交試驗，測定木蹄層孔菌液體培養(yǎng)菌絲球及發(fā)酵液多糖含量；分析不同因素對液體菌種發(fā)酵液多糖含量的影響，從而找到最佳碳源、氮源及其培養(yǎng)條件，以及明顯提高多糖濃度的方法，從而對于木蹄層孔菌發(fā)酵液中多糖的開發(fā)提供重要的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

木蹄層孔菌TNCY001，保藏在天津農(nóng)學(xué)院食用菌研發(fā)中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，pH自然。

初始液體培養(yǎng)基：蔗糖25.0 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、K2HPO41.5 g·L-1、KH2PO41.5 g·L-1、蛋白胨15.0 g·L-1，VB10.045 g·L-1，初始 pH 6.0，裝液量100 mL，轉(zhuǎn)速 140 r·min-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以葡萄糖量（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 繪制液體培養(yǎng)的生長曲線

按照基礎(chǔ)培養(yǎng)條件及配方，在搖瓶培養(yǎng)過程中的1 h～168 h之間取樣，前3 d每24小時取樣1次，之后每12小時取樣1次，過濾、烘干，計算菌絲球干重。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，菌絲球干重、發(fā)酵液多糖產(chǎn)量為縱坐標(biāo)繪制菌絲生長曲線圖，并根據(jù)生長曲線圖確定取樣時間。

1.2.3 液體菌種培養(yǎng)基碳源、氮源篩選

分別以蔗糖、馬鈴薯、葡萄糖、麥芽糖作為碳源，每個處理3組重復(fù)，測定菌絲球干重及發(fā)酵液多糖含量，確定最佳碳源。

在確定的最佳碳源基礎(chǔ)上，分別以酵母浸粉、牛肉浸膏、蛋白胨、硫酸銨、玉米漿作為氮源，3組重復(fù)，測定菌絲球干重及發(fā)酵液多糖含量，確定最佳氮源。

1.2.4 液體菌種培養(yǎng)基碳源、氮源添加量的篩選

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下，最佳碳源根據(jù)1.2.3確定其添加量為 5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1、25 g·L-1，3組重復(fù)，取樣時間根據(jù)1.2.2確定的最佳培養(yǎng)時間，測定菌絲球干重以發(fā)酵液多糖含量，確定最佳添加量。

在最佳碳源添加計量條件下，使最佳氮源的添加水平為 5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1、25 g·L-1，3組重復(fù)，最佳培養(yǎng)時間取樣，測定菌絲球干重以發(fā)酵液多糖含量，確定氮源最佳添加量。

1.2.5 液體菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)條件篩選

在上述優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，設(shè)置不同裝液量梯度，裝液量依次為50 mL、70 mL、90 mL、110 mL，最佳培養(yǎng)時間取樣，測定菌絲球干重以發(fā)酵液多糖含量，確定最佳裝液量。

在上述優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，最佳裝液量條件下，設(shè)置不同初始pH梯度，依次為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，最佳培養(yǎng)時間取樣，測定菌絲球干重以發(fā)酵液多糖含量，確定最佳初始pH。

在上述優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)速梯度為110 r·min-1、140 r·min-1、170 r·min-1、200 r·min-1，最佳培養(yǎng)時間培養(yǎng)，測定菌絲球干重以發(fā)酵液多糖含量，確定最佳轉(zhuǎn)速。

1.2.6 正交試驗設(shè)計

通過單因素試驗，確定木蹄層孔菌菌絲液體培養(yǎng)的碳源和氮源，K2HPO4、KH2PO4為培養(yǎng)基中主要的無機鹽成分，并在篩選最佳碳源、氮源添加量試驗的基礎(chǔ)上，以初始pH、轉(zhuǎn)速、裝液量為培養(yǎng)條件，設(shè)計L16(45)正交試驗，正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。根據(jù)菌絲生長曲線明確最佳培養(yǎng)時間，并測定菌絲球干重與發(fā)酵液多糖含量，確定木蹄層孔菌的最佳液體發(fā)酵工藝條件。

表1 L16(45)正交試驗因素水平設(shè)計表Tab.1 Factors and their level of L16(45)orthogonal test

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010和DPS 7.05軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用Duncan’s新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

由圖1可以看出，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.999 6，線性關(guān)系良好，可以用于發(fā)酵液多糖濃度計算。

2.2 木蹄層孔菌液體培養(yǎng)的生長曲線

木蹄層孔菌菌絲生長情況見圖2。

由圖2可知，菌絲球在培養(yǎng)過程中干重呈現(xiàn)先增加達到穩(wěn)定后迅速下降的趨勢，在培養(yǎng)前24 h有萌發(fā)現(xiàn)象，在接種的菌塊表面有少量絨毛狀菌絲；48 h～84 h，菌絲開始緩慢生長，培養(yǎng)基中出現(xiàn)少量菌絲和較小的菌球；84 h～120 h，菌絲生長達到快速生長期，培養(yǎng)基中的菌球數(shù)量明顯增多，菌球變大；至第156小時，菌絲球干重達到穩(wěn)定值且最大為0.270 g·L-1，156 h后菌絲球干重開始下降，因此，根據(jù)木蹄層孔菌菌絲生長曲線確定最佳取樣時間為156 h。木蹄層孔菌發(fā)酵液多糖情況見圖3。

由圖3所示，發(fā)酵液中多糖濃度在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在培養(yǎng)的前132 h中，發(fā)酵液多糖濃度緩慢增加，在132 h～168 h，發(fā)酵液多糖濃度達到穩(wěn)定值且最大為0.199 g·L-1，在168 h之后發(fā)酵液多糖濃度迅速下降，因此，根據(jù)木蹄層孔菌發(fā)酵液多糖濃度變化曲線確定最佳取樣時間為156 h～168 h。綜合考慮，確定木蹄層孔菌最佳取樣時間為156 h。

2.3 木蹄層孔菌液體菌種碳源、氮源篩選

不同碳源對木蹄層孔菌發(fā)酵液中多糖濃度及菌絲球干重的影響見圖4。

由圖4可知，不同碳源下，菌絲球干重相差不大，使用葡萄糖作為碳源的菌絲球干重稍高于使用麥芽糖、蔗糖、馬鈴薯作為碳源的菌絲球干重，木蹄層孔菌菌絲對葡萄糖的利用能力最強，菌絲球干重為0.15 g·L-1；不同碳源下，以蔗糖為碳源的發(fā)酵液多糖產(chǎn)量最高達到0.424 g·L-1，以菌絲球干重及發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，綜合考慮，選取最佳碳源為蔗糖。以不同氮源對木蹄層孔菌進行培養(yǎng)，發(fā)酵液中多糖濃度及菌絲球干重見圖5。

由圖5可知，含酵母浸粉的液體培養(yǎng)基中菌絲球干重最大為0.736 g·L-1，表明木蹄層孔菌菌絲對酵母浸粉的利用能力最強；以酵母浸粉為氮源的發(fā)酵液多糖產(chǎn)量最高達到1.102 g·L-1，以菌絲球干重及發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，選取最佳氮源為酵母浸粉。

2.4 木蹄層孔菌菌液體菌種碳源、氮源添加量的篩選

2.4.1 碳源添加量的篩選

以最佳碳源蔗糖不同添加量對木蹄層孔菌發(fā)酵液中多糖濃度及菌絲球干重影響見圖6。

由圖6可知，在蔗糖添加水平為5 g·L-1～25 g·L-1的條件下，菌絲球干重呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，且在蔗糖添加量為15 g·L-1時，菌絲球干重達到最大為0.533 g·L-1，高于其他處理；在蔗糖添加量為20 g·L-1時，發(fā)酵液多糖產(chǎn)量達到最大為1.341 g·L-1。以菌絲球干重及發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，綜合考慮，碳源最佳添加量為20 g·L-1。

2.4.2 氮源添加量的篩選

最佳氮源酵母浸粉不同添加量對木蹄層孔菌發(fā)酵液中多糖濃度及菌絲球干重影響見圖7。

由圖7可知，在酵母浸粉添加水平為5 g·L-1～25 g·L-1的條件下，菌絲球干重呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，且在酵母浸粉添加量為15 g·L-1時，菌絲球干重達到最大為2.413 g·L-1，高于其他處理；在酵母浸粉添加量為20 g·L-1時，發(fā)酵液多糖產(chǎn)量達到最大為1.114 g·L-1，以菌絲球干重及發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，綜合考慮，氮源最佳添加量為20 g·L-1。

2.5 木蹄層孔菌液體菌種發(fā)酵條件篩選

不同裝液量對木蹄層孔菌發(fā)酵液中多糖濃度及菌絲球干重影響見圖8。

由圖8可知，搖瓶裝液量越大，搖瓶中溶氧量反而降低，菌絲球干重也降低，當(dāng)裝液量為110 mL時，搖瓶中溶氧量高，菌絲生長較快，代謝旺盛，菌絲球干重最大為3.022 g·L-1，顯著高于其他各處理；發(fā)酵液多糖含量先上升后下降，在裝液量為70 mL時，發(fā)酵液多糖含量最高為1.488 g·L-1。以菌絲球干重及發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，綜合考慮，最佳裝液量為70 mL。

pH高低影響細胞膜的電荷變化，酶活性以及菌絲生物量也會受該因素影響[7]。不同pH對木蹄層孔菌發(fā)酵液中多糖濃度及菌絲球干重的影響見圖9。

圖9表明，發(fā)酵液初始pH為5.0、6.0時菌絲球干重變化不大，當(dāng)初始pH為7.0時，菌絲球干重下降，在初始pH為5.0時，菌絲球干重最大為2.402 g·L-1；發(fā)酵液多糖含量先上升后下降，在初始pH為6.0時，發(fā)酵液多糖含量最高為1.517 g·L-1。以菌絲球干重及發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，綜合考慮，選取最佳初始pH為6.0。

轉(zhuǎn)速越高，搖瓶中的溶氧量越多，越有利于菌絲的生長；但轉(zhuǎn)速過高會產(chǎn)生較大的剪切力，在培養(yǎng)過程中不能夠形成菌球，進而影響菌絲生長[8]。不同轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵液多糖濃度及菌絲球干重變化見圖10。

由圖10可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，搖瓶中溶氧量逐漸增加，但球絲球干重呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在轉(zhuǎn)速為140 r·min-1的條件下，菌絲球干重達到最大為2.176 g·L-1；發(fā)酵液多糖濃度在200 r·min-1達到最大為1.111 g·L-1，以菌絲球干重及發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，綜合考慮，選取最佳轉(zhuǎn)速為 200 r·min-1。

2.6 正交試驗結(jié)果分析

L16(45)正交試驗結(jié)果直觀分析表見表2，最佳碳源確定為蔗糖，最佳氮源為酵母浸粉。菌絲球干重方差分析見表3。

表2 L16(45)正交試驗結(jié)果直觀分析表Tab.2 Intuitive analysis table for the result of L16(45)orthogonal test

表3 菌絲球干重方差分析Tab.3 Variance analysis on mycelium dry weight

由表2可知，在不同的培養(yǎng)基組分下，搖瓶中木蹄層孔菌菌絲球干重以編號8（A2B4C3D2E1）最大，為6.685 g·L-1；根據(jù)極差分析結(jié)果，影響木蹄層孔菌菌絲球干重的各因素的主次順序為：初始pH＞裝液量＞蔗糖＞酵母浸粉＞轉(zhuǎn)速。

由表2結(jié)合表3方差分析結(jié)果表明，除裝液量對菌絲球干重?zé)o顯著差異，其余各因素對菌絲球干重呈極顯著差異，說明氧氣含量、養(yǎng)分供應(yīng)、pH對木蹄層孔菌發(fā)酵菌絲球干重影響較大，其中轉(zhuǎn)速是發(fā)酵過程中增加氧氣供應(yīng)的主要因素，碳氮源是菌種進行生長發(fā)育的主要營養(yǎng)物質(zhì)，另外木蹄層孔菌又是一種喜酸菌種，適合的pH對其生長影響很大。從上述分析來看，極差分析與方差分析結(jié)果稍有偏差，可能是因為極差分析未能利用全部測量指標(biāo)的信息，只指明了測定值的最大范圍，不能細致地反映測量值彼此相符合的程度，正交試驗彌補了極差分析缺陷。因此應(yīng)以正交方差分析結(jié)果為主。根據(jù)正交試驗篩選出滿足木蹄層孔菌生長代謝的最佳培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件組合為A2B4C4D2E1，這與16個處理中編號8（A2B4C3D2E1）的結(jié)果不一致；經(jīng)驗證，在配方8條件下培養(yǎng)，木蹄層孔菌絲球干重達到6.685 g·L-1，優(yōu)于正交試驗篩選最佳培養(yǎng)基。即適合木蹄層孔菌菌絲球生長的最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蔗糖15 g·L-1，酵母浸粉25 g·L-1，裝液量90 mL，轉(zhuǎn)速 110 r·min-1，初始 pH 5.0。

由表2可知，在不同的培養(yǎng)基組分下，在不同的培養(yǎng)基組分下，木蹄層孔菌液體發(fā)酵多糖濃度以A2B3C4D1E2處理最大，為1.444 g·L-1；根據(jù)極差分析結(jié)果，影響發(fā)酵液多糖濃度的各因素的主次順序為：轉(zhuǎn)速＞酵母浸粉＞裝液量＞蔗糖＞初始pH。發(fā)酵液多糖產(chǎn)量方差分析見表4。

表4 發(fā)酵液多糖產(chǎn)量方差分析Tab.4 Variance analysis on fermentation liquid polysaccharide yield

由表2結(jié)合表4方差分析結(jié)果表明，各因素均達極顯著水平；根據(jù)正交試驗篩選出適合木蹄層孔菌產(chǎn)發(fā)酵多糖液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合為A1B4C4D4E2，這與16個處理中最大值組合編號7（A2B3C4D1E3）不一致；經(jīng)驗證，在組合正交試驗篩選出的配方下培養(yǎng)，木蹄層孔菌液體發(fā)酵多糖濃度量達到1.512 g·L-1，優(yōu)于A2B3C4D1E3，即適合木蹄層孔菌菌株多糖含量的最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖10 g·L-1，酵母浸粉25 g·L-1，裝液量110 mL，轉(zhuǎn)速140 r·min-1，初始為pH 6.0。

3 結(jié)論

野生木蹄層孔菌的多糖獲得較難，本試驗通過對保藏菌種進行分離、培養(yǎng)、純化、液體發(fā)酵并篩選出適宜培養(yǎng)條件獲得較高的多糖產(chǎn)量，為木蹄層孔菌多糖開發(fā)研究提供依據(jù)。

碳源和氮源是菌絲生長過程中最主要的營養(yǎng)物質(zhì)，菌絲在不同的營養(yǎng)物質(zhì)條件下的生長速率以及在生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物含量不同[9]。聶建軍等[10]研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖時，菌絲生物量和胞外多糖產(chǎn)量均明顯高于蔗糖，分別提高了5.83倍和0.85倍。因此，篩選合適的碳氮源在提高木蹄層孔菌液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量上十分重要。

總體來看，試驗中所采用的氮源均適合木蹄層孔菌菌絲的生長，但對酵母浸粉的利用效率最高，故選用酵母浸粉為最佳氮源。初始pH篩選結(jié)果表明木蹄層孔菌菌絲液體培養(yǎng)最佳初始pH為5.0，與大部分野生真菌喜歡酸性環(huán)境生長研究結(jié)果一致。將單因素試驗與正交試驗相結(jié)合，最終篩選出適合木蹄層孔菌液體培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件為：蔗糖10 g·L-1、酵母浸粉 25.0 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、磷酸二氫鉀 1.5 g·L-1、磷酸氫二鉀 1.5 g·L-1，VB10.045 g·L-1，初始pH 6.0，裝液量110 mL，培養(yǎng)溫度25℃，靜置時間24 h，轉(zhuǎn)速140 r·min-1，在此條件下木蹄層孔菌液體發(fā)酵多糖濃度量達到1.512 g·L-1，是優(yōu)化前（0.199 g·L-1）的7.6倍。目前關(guān)于多糖尤其是野生真菌發(fā)酵液中多糖的研究較少，因此本文的研究結(jié)果對于野生真菌發(fā)酵液中多糖的開發(fā)具有十分重要的意義。