一種野生羊肚菌的馴化栽培研究*

賀國強，魏金康，吳尚軍，胡曉艷，趙?？?，鄧德江

（北京市農業技術推廣站，北京100029）

羊肚菌屬（Morchella） 是一類珍稀且美味的食（藥）用菌，羊肚菌的人工栽培受到全球廣泛關注。法國最早開展羊肚菌的馴化栽培研究[1-2]。1982年美國的Ron Ower等[3]首次獲得了室內栽培的羊肚菌子實體，隨后美國進行了數年的羊肚菌產業化工廠栽培，但均以失敗告終。上世紀80年代我國開始羊肚菌的相關研究，于90年代成功實現了人工栽培羊肚菌，并開創了羊肚菌大田栽培模式[4-6]，對于羊肚菌產業化具有重要意義。自2012年我國羊肚菌進入了產業化時期以來，栽培由最初的2.0×106m2，迅速增長到了2016年的2.3×107m2[7]。

羊肚菌的品種選育對于栽培開發至關重要。目前已知羊肚菌屬有61個種，東亞或中國分布了該屬近一半的物種（30種），歐洲分布有23種，北美分布有19種[8]。根據形態學的特征如菌蓋近中部與菌柄是否分離、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋的形狀和顏色、蓋表棱紋排列和凹坑的深淺等，羊肚菌屬被分為3個大類：黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類和半開羊肚菌類；但是基于LSU、ef1-α、rpb1和rpb2四個基因的核苷酸序列系統發育分析，發現羊肚菌屬可劃分為黃色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade） 和變紅羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade）[9-11]。部分黑色種類的羊肚菌如梯紋羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sexte－lata）、七妹羊肚菌（M.septimelata）、尖頂羊肚菌（M.conica）、羊肚菌（M.esculenta） 已成功馴化栽培，其中商業化栽培主要以梯紋羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌為主[12-15]。

開展野生羊肚菌的采集和收集，積累了不少種質資源，通過對羊肚菌菌株（羊CP）的菌絲生物學特性和子實體農藝性狀進行研究，馴化栽培優質資源，以期為商業開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生羊肚菌子實體于2014年采集自北京市昌平區延壽鎮黑山寨（北緯N40°21′11.99″， 東經E116°17′47.68″）。經組織分離獲得純培養菌絲體，菌株命名為羊CP，由北京市農業技術推廣站食用菌試驗室保藏（館藏編號：BJAESF201401）。經ITS序列鑒定，結合Blast在線比對（98%），結果表明菌株羊CP是歐氏羊肚菌 Morchella owneri X.H.Du，MycoBank登錄號為 MB828952[16]。

1.2 培養基

菌株的分離與保藏，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。菌絲最適培養條件研究，采用基礎培養基和加富培養基[17]。

1.3 菌絲體培養條件

1.3.1 溫度試驗

用已滅菌打孔器（直徑6 mm）均勻截取已活化的菌絲體塊，并接種于基礎培養基，分別于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃恒溫避光培養，每個處理設置3個重復，培養7 d后觀察記錄。

1.3.2 pH試驗

采用精密pH試紙，用10%氫氧化鈉和10%鹽酸在超凈工作臺中調節滅菌后的基礎培養基pH，調節后的培養基pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，每個pH設置3個重復，接種后25℃避光培養7 d，觀察記錄。

1.3.3 碳源試驗

以基礎培養基中20 g葡萄糖的含碳量為標準，分別以相等含碳量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖代替基礎培養基中的葡萄糖，其他成分同基礎培養基。每個處理3次重復，接種后25℃避光培養7 d，觀察記錄。

1.3.4 氮源試驗

以基礎培養基中2 g蛋白胨的含氮量為標準，分別以相等含氮量的酵母粉、氯化銨、硝酸銨、黃豆粉、麩皮代替基礎培養基中的蛋白胨。其他成分同基礎培養基，每個處理3次重復，接種后25℃避光培養7 d，觀察記錄。

1.3.5 菌絲日均生長速度測定

以同批試驗中菌絲生長最快的菌落為標準，最快菌落的菌絲將近長滿90 mm平皿而未滿時作為測量終點，對其他菌落同時進行測量。最后取3個測量數據的平均值。日均生長速度（V，cm·d-1）的計算公式為：

式中：R2為最后1次測量菌落半徑（cm）；R1為第1次測量菌落半徑（cm）；D為菌落培養天數（d）。

1.4 馴化和栽培

1.4.1 栽培種制作

按照木屑65%、小麥30%、腐殖土3%、石膏1%、白灰1%，含水量60%的配方拌料，分別裝入聚丙烯塑料袋（35.0 cm×16.5 cm）中，每袋裝濕料1.0 kg。每袋接入1塊原種菌種（大小1.0 cm×1.0 cm）。培養溫度20℃，空氣濕度60%，避光培養直至長滿菌包。

1.4.2 播種與發菌

播種前將土面澆濕，待水滲入土壤不粘手時開始播種。在土面上鋪撒滅菌后的基料。將羊肚菌栽培種從菌種瓶（袋）中挖出，揉碎成顆粒狀，均勻撒在土層表面，然后使用微型旋耕機將土面旋耕1次。菌種用量為 0.6 kg·m-2～0.9 kg·m-2。按南北方向做畦床，床寬1.0 m，高15 cm，畦間溝寬0.4 m。播種后10 d～15 d，待菌絲長滿畦面后開始產生分生孢子時，放置滅菌后的營養袋。營養袋內培養料的配方為稻殼69%、小麥30%和石灰1%。將營養袋縱向的1個面用釘板打20個～30個孔，使打孔面貼近地面。每平方米用3袋營養袋（折幅×長度=15 cm×35 cm）。

1.4.3 出菇

當羊肚菌發菌60 d后，畦面白色菌絲褪去，進入出菇期。撤掉外援營養袋，調節土壤含水量20%和溫度10℃～12℃。羊肚菌分化原基后適當增強光照，溫室內溫度控制在15℃～20℃。保持空間環境的空氣相對濕度在75%～80%，將光照強度控制在600 lx～800 lx。每天通風2次～4次，每次通風時間維持在30 min左右，使二氧化碳濃度控制在1 964 mg·m-3以內。出菇后，比較各品種羊肚菌子實體形態及栽培產量。

1.5 統計學分析

所有數據采用SPSS 20.0統計軟件進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對菌絲體生長的影響

不同碳源對菌絲體生長的影響見圖1、表1。

表1 碳源對羊CP（Morchella owneri）菌絲體生長速度影響Tab.1 Effect of Carbon sources on growth speed of Morchella owneri mycelium

如圖1、表1所示，羊CP在不同碳源培養基中均能生長，但菌絲利用碳源能力不同，因而生長速率有差異。在不同碳源培養基上，羊CP菌絲生長速度最快為乳糖，其次為可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖，最慢的為麥芽糖。羊肚菌菌絲生長迅速，初期無色或淺白色，菌絲迅速長滿平板，隨著培養時間的延長，菌絲逐漸濃密并轉為淺黃至黃褐色，并產生淺黃至棕黃色菌核。添加葡萄糖的培養基菌絲由白色最終變為淺黃色；添加蔗糖和乳糖培養基的菌絲由白色最終變為黃色；添加麥芽糖和可溶性淀粉培養基的菌絲由白色最終變為棕色。菌核產生量最大為葡萄糖、蔗糖，其次為可溶性淀粉、麥芽糖，最小的為乳糖。綜合菌絲生長速度和菌核長勢，羊CP菌絲生長最適的碳源為乳糖；產生菌核最適合的碳源為葡萄糖和蔗糖。

2.2 不同氮源對菌絲體生長的影響

不同氮源對菌絲體生長的影響見圖2、表2。

表2 氮源對羊CP（Morchella owneri）菌絲體生長速度的影響Tab.2 Effect of nitrogen sources on growth speed of Morchella owneri mycelium

如圖2、表2所示，羊CP在不同氮源培養基中均能生長。在不同氮源培養基上，羊CP菌絲生長速度最快為黃豆粉和蛋白胨，其次為酵母浸粉、硝酸銨、麩皮，最慢為氯化銨。羊肚菌菌絲生長迅速，初期無色或淺白色，菌絲迅速長滿平板，隨著培養時間的延長，菌絲逐漸濃密并轉為淺黃色，并產生淺黃色菌核。添加蛋白胨和麩皮培養基的菌絲由白色最終變為淺棕色；添加酵母粉培養基的菌絲由白色最終變為淺黃色；添加黃豆粉培養基的菌絲由白色最終變為棕色；添加氯化銨和硝酸銨培養基的菌絲呈羽毛狀，不變色。菌核產生量最大為蛋白胨和黃豆粉，其次為酵母粉，最小為麩皮、硝酸銨、氯化銨。綜合菌絲生長速度和長勢，羊CP菌絲生長的最適合氮源為黃豆粉和蛋白胨，菌核產生的最適氮源為酵母粉。

2.3 不同溫度對菌絲體生長的影響

羊CP在不同溫度培養基生長情況見圖3、表3。

表3 不同溫度對羊CP（Morchella owneri）菌絲體生長速度影響Tab.3 Effect of different temperatures on growth speed of Morchella owneri mycelium

由圖3、表3可知，羊CP菌絲的生長溫度范圍為10℃～25℃，在5℃和30℃條件下均可萌發，但幾乎不生長。菌絲生長速率依次為25℃＞20℃＞15℃＞10℃＞30℃和5℃。在20℃～25℃，羊肚菌菌絲生長迅速，初期無色或淺白色，菌絲迅速長滿平板，隨著培養時間的延長，菌絲逐漸濃密并轉色，并產生菌核。隨著培養溫度的增高，菌絲由淺黃色很快變為淺棕色或棕色，表明老化速度加快。當菌絲成熟時開始產生菌核，不同溫度條件下產生菌核的快慢和數量不同。菌核產生量依次為：25℃＞20℃＞15℃＞10℃。在5℃和30℃條件下，未產生菌核。綜合菌絲生長和菌核產生情況，羊CP菌絲生長和菌核產生的最適合溫度均為25℃。

2.4 不同pH對菌絲體生長的影響

羊CP在pH 4～pH 11均能生長，但菌絲在不同pH條件下生長情況差異較大，見圖4、表4。

表4 不同pH對羊CP（Morchella owneri）菌絲體生長速度影響Tab.4 Effect of different temperatures on growth speed of Morchella owneri mycelium

由圖4、表4可知，羊CP在不同pH培養基上菌絲生長速度最快為7.0和8.0，其次是6.0、9.0、10.0、11.0和5.0，最慢的為4.0。在不同pH條件下，羊肚菌菌絲生長迅速，初期無色或淺白色，菌絲迅速長滿平板，隨著培養時間的延長，菌絲逐漸濃密并轉色，并產生菌核。隨著pH的增加，菌絲顏色加深，至8.0達到最深，然后變后變淺。當pH為4.0、5.0、10.0、11.0時，菌絲變為淺黃色；當pH為7.0和9.0時，菌絲變為淺棕色；當pH為8.0時，菌絲變為棕色。菌核產生量最大的pH為7.0、8.0、9.0、6.0，其次是10.0和5.0，最小的為4.0。綜合菌絲生長速度和長勢，羊CP的最適pH為8.0。

2.5 羊CP與其他羊肚菌品種的栽培產量比較

在室溫20℃、濕度60%的室內暗光培養條件下，栽培種20 d菌絲長滿菌包。在日光溫室內播種后，菌絲7 d可穿透土層，長滿畦面。55 d～70 d，土面出現白色透明的圓斑狀原基，5 d～8 d后發育成幼菇，15 d～20 d原基長大，此時采收第一潮菇。采收的栽培子實體高5 cm～8 cm，菌蓋直徑1.5 cm～2.1 cm，馴化栽培的羊CP子實體見圖5，各品種羊肚菌菌株的子實體比較見圖6。

由圖6可知，相較其他栽培品種羊CP（子實體個頭較小，其原基發生數量多，菇體生長的密度較高，密度最大處0.2 m2成菇數量超過500個，其與其他羊肚菌品種的栽培產量比較見表5。

表5 羊CP（Morchella owneri）與其他羊肚菌品種的栽培產量比較Tab.5 Average yields between Morchella owneri and other Morchella spp.strains

根據表5測產統計，羊CP的平均產量為1.235 kg·m-2，僅次于新馴化的品種HM、T2；較目前大規模生產使用的羊1（平均產量為0.880 kg·m-2）和羊4（平均產量為1.150 kg·m-2），產量分別提高40.34%、7.40%。此外，羊CP子囊果更接近于野生羊肚菌，肉質脆嫩，口感較好，具有一定開發價值。試驗初步結果表明，羊CP具有在日光溫室內栽培推廣的價值。

3 結論與討論

羊肚菌是一類具有重要經濟價值和科研價值的食（藥）用真菌。隨著商業化人工栽培技術的成功，羊肚菌栽培大面積推廣，因此近年來野生羊肚菌資源成為國內外的研究熱點。

菌絲生長速度和長勢受到營養和生長環境的影響，是選擇優質菌株的重要指標之一[18]。不同菌株在不同培養條件下生長特性差異往往很大。羊CP可以利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉等作為碳源，最適碳源為乳糖。前人的研究也表明，羊肚菌（M.impoauna） A1菌株的最適碳源為甘露醇、阿拉伯糖和乳糖[19]，二者相一致。但不同種羊肚菌的最適碳源并不相同。羊肚菌（M.esculenta）最適碳源為可溶性淀粉[20-21]；對于尖頂羊肚菌，合適的碳源是蔗糖、淀粉、麥芽糖和葡萄糖[22-23]。

羊CP最適氮源為蛋白胨和黃豆粉，最適氮源蛋白胨與前人報道一致[19]。羊肚菌對氮源的利用情況也因種類不同有所差異。羊肚菌（M.esculenta）最適氮源為尿素、蛋白胨或硝酸銨，且因菌株不同存在差異[20-21]；對于尖頂羊肚菌，最適氮源是天冬氨酸、半光氨酸和亞硝酸鈉[22]。

羊CP最適溫度為25℃，與前人的研究一致[19,21,24-25]，與陳芳草的研究不同[23]。羊CP最適 pH為8.0，與龔燕川的研究一致[26]。謝放等[21]報道即使是同一個種羊肚菌的不同菌株，最適pH也不相同。野生條件下，羊肚菌經常發生于石灰性土壤和火燒地環境[27]。據此推測，羊肚菌菌絲生長最適pH多為近中性至偏堿性條件。

ITS鑒定是真菌分子鑒定的重要手段之一[28-29]。羊CP雖然經過ITS鑒定為歐氏羊肚菌（M.owneri），屬于黑色羊肚菌系[16]，但其子實體形態特征與目前大規模栽培使用的梯棱羊肚菌存在差異。表現為子實體菌蓋為灰褐色、尖錐形，縱棱排列較規則，呈波浪狀彎曲，橫棱不明顯，凹坑稍淺，接近于野生羊肚菌的特征，表明羊CP有馴化為新栽培品種的可能。從栽培試驗的鮮菇產量統計看，羊CP相較于目前商業化栽培的梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌菌株的產量均有所提高。這也表明羊CP具備栽培推廣的價值，但其穩產性和抗病性等特性需要進一步進行栽培試驗。

綜上，通過對采集自北京的1株野生羊肚菌羊CP進行菌絲培養條件研究和大田栽培試驗，結果明確了其最適碳源、氮源、溫度和最適pH，可為進一步研究馴化羊CP菌株提供參考。羊CP菌株栽培試驗中，鮮菇產量達1.235 kg·m-2，子實體形態接近野生狀態，肉質脆嫩，具有一定栽培推廣價值。