大孔吸附樹脂分離純化羊肚菌水提取物中糖苷酶抑制劑的研究*

張雪松，凡軍民，謝春芹，曹 正，劉 碩

（江蘇農林職業技術學院茶與食品科技學院，江蘇 句容 212400）

隨著當今人們生活方式的改變，糖尿病的發病率也在不斷攀升。通過延緩糖類的消化、吸收從而降低血糖，是治療糖尿病的一個重要途徑[1]。人體攝入的糖類主要在小腸內被消化吸收，如在淀粉酶的作用下食物中的淀粉水解為麥芽糖，然后被α-葡萄糖苷酶水解為可以被小腸吸收的葡萄糖[2-3]。因此可以通過服用糖苷酶抑制劑抑制糖類消化，減緩人體內糖類的吸收，最終達到抑制餐后血糖快速升高的目的。目前常見的研究方法為體外酶活性抑制試驗，即以淀粉、麥芽糖、PNPG或蔗糖為底物，通過比色法測定糖苷酶抑制率[4]。

當前糖苷酶抑制劑的常用藥物有阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，但都存在不同程度的不良反應[5]。很多中藥材以及食（藥）用菌提取物對于糖尿病具有一定的治療及減緩癥狀的作用，相對西藥無明顯副作用且成本較低，而多糖是其主要生物活性成分[6]。研究表明，靈芝、蟲草、香菇等食用菌中的多糖具有降低血糖的功效，對糖苷酶具有一定的抑制作用[7]。羊肚菌（Morchella spp.）由于其菌蓋布滿網狀褶皺，形狀如羊肚而得名。是一種珍稀的食用菌，其營養豐富，含有大量氨基酸及多糖[8]。目前，有關羊肚菌提取物生物活性的研究主要集中在抗氧化、抑菌、抗疲勞、抑制腫瘤及抗癌等方面[9]，而幾乎未有關于羊肚菌提取物降糖方面的研究，缺乏其體外糖苷酶活性抑制試驗，對其分離純化研究的報道更是少見。

大孔吸附樹脂是一種新型的人工合成有機高聚物吸附劑，吸附性能優異且價格便宜，通過選擇性地吸附有機物質，以達到分離純化的目的。目前已廣泛的應用于各種中草藥有效活性成分的分離及純化研究[10]。研究表明，大孔吸附樹脂對于許多食用菌提取物具有較好的吸附作用，常用于食用菌提取物中多糖的分離純化，如蟲草多糖[11]、靈芝多糖[12]、香菇多糖[13]等，具有較好的分離純化效果。課題組前期的研究表明羊肚菌水提取物對α-淀粉酶、麥芽糖酶、α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶均有一定的抑制作用。分別以α-淀粉酶抑制率、麥芽糖酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率、以及蔗糖酶抑制率為參數，采用大孔吸附樹脂分離純化羊肚菌水提取物中的糖苷酶抑制劑，優化其分離純化條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六妹羊肚菌（Morchella sextelata），江蘇農林職業技術學院食用菌教學基地栽培。

麥芽糖、蔗糖、淀粉、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、磷酸二氫鉀、3，5-二硝基水楊酸、磷酸氫二鉀、鹽酸、氯仿、正丁醇、95%乙醇、4-硝基苯基-α-D吡喃半乳糖苷均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

蔗糖酶（100 U·mg-1）、α-淀粉酶（20 000 U·mL-1）、α-葡萄糖苷酶（700 000 U·mL-1）、麥芽糖酶（50 U·mg-1），上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo公司；GZLYZ-1真空冷凍干燥機，諸城市博匯機械有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；KQ-500DV型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；SY-5000旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；CP214電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；磁力攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

2 試驗方法

2.1 樣品的制備

參考劉奕辰水提醇沉法[14]，采用超聲波輔助提取[15]并略作修改。取羊肚菌子實體洗凈、去除雜質，置于105℃的烘箱中滅菌10 min，65℃烘干。將烘干的羊肚菌子實體粉碎過40目篩，并以1∶10的比例與蒸餾水混合。設置超聲功率為400 W，在55℃下提取45 min，提取2次，將提取物合并，于4℃冰箱中過夜。取上清液，通過4層紗布過濾，離心獲得上清液。在85℃水浴中濃縮，通過Sevag法將濃縮液離心2次以獲得上清液。加入6倍體積的無水乙醇，在-20℃的冰箱過夜，沉淀多糖。棄去上清液，收集沉淀物，真空冷凍干燥后得到羊肚菌多糖。

2.2 糖苷酶抑制活性測定

2.2.1 淀粉酶抑制率的測定

α-淀粉酶抑制率的測定方法采用讓一峰[16]的方法略加改動。加入2%淀粉溶液0.5 mL，在抑制管和抑制對照管中加入1.0 mL樣品溶液，在空白管和空白對照管中加入1.0 mL蒸餾水作為對照，后于空白管和抑制劑管加入α-淀粉酶稀釋液（20 U·mL-1）0.5 mL，對照管加入0.5 mL蒸餾水。置于37℃水浴10 min后，加入配置好的DNS試劑1.0 mL，再放入沸水浴中5 min，加入10.0 mL蒸餾水，冷卻至室溫，最后于540 nm處測其吸光值。酶抑制試驗重復3次。抑制率（InR，%）計算公式為：

式中：A0、AⅠ、AⅢ和AⅢ分別為540 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

2.2.2 麥芽糖酶抑制率的測定

麥芽糖酶抑制率的測定采用吳彬彬[17]的方法略加改動。加入2%麥芽糖溶液0.5 mL，在抑制管和抑制對照管中加入1.0 mL樣品溶液，在空白管和空白對照管中加入蒸餾水1.0 mL進行對照，后在空白管和抑制劑管加入0.5 mL麥芽糖酶（20 U·mL-1），對照管加入0.5 mL蒸餾水。置于37℃水浴中反應10 min后，加入1.0 mL DNS，于沸水浴中反應5 min，加入10.0 mL蒸餾水，冷卻至室溫，最后于405 nm處測定吸光值（A）。酶抑制試驗重復3次。抑制率（InR，%） 計算公式為：

式中：A1、A2、A3和A4分別為為405 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

2.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定方法依據陳海君[18]的方法略加改動。加入PNPG溶液2.0 mL，在抑制管和抑制對照管中加入1.0 mL的樣品溶液，在空白管和空白對照管中加入1.0 mL蒸餾水進行對照，再加入2mL磷酸鹽緩沖溶液。置于37℃水浴中保溫10 min，在空白管及抑制管加入酶液1 mL（20 U·mL-1），在對照管加入蒸餾水1 mL。再次放入37℃水浴中保溫15 min，加入5 mL碳酸鈉溶液終止試驗。冷卻至室溫，于405 nm處測得吸光值（A）。酶抑制試驗重復3次。抑制率（InR，%）計算公式為：

式中：A1、A2、A3和A4分別為405 nm下空白管空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

2.2.4 蔗糖酶抑制率的測定

蔗糖酶抑制率的測定方法采用王璐瑤[19]的方法稍作修改。加入2%蔗糖溶液0.5 mL，在抑制管和抑制對照管中加入1.0 mL樣品溶液，在空白管和空白對照管中加入1.0 mL蒸餾水進行對照，后于空白管和抑制劑管加入0.5 mL蔗糖酶（20 U·mL-1），對照管加入0.5 mL蒸餾水。置于37℃水浴中反應10 min后，加入1.0 mL DNS，于沸水浴中反應5 min，加入10.0 mL蒸餾水，冷卻至室溫，最后于550 nm處測定吸光值（A）。酶抑制試驗重復3次。抑制率（InR，%）計算公式：

式中：A5、A6、A7和A8分別為為550 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

2.3 大孔吸附樹脂的預處理

按參考文獻[20]稱取適量大孔吸附樹脂，用去離子水潤洗，去除樹脂表面雜質，濾去水分，加入3倍樹脂體積的95%乙醇浸泡24 h，趕出樹脂中的氣泡并使其充分膨脹。后將樹脂用去離子水沖洗至無明顯乙醇氣味，且流出液不渾濁為止，放在4℃陰暗處備用。本試驗選取了5種不同的樹脂，分別為AB-8、S-8、D101、NKA-9、LX-17。大孔吸附樹脂相關參數見表1。

表1 吸附樹脂性能參數Tab.1 Adsorption resin performance parameters

2.4 大孔吸附樹脂篩選

靜態吸附均按照參考文獻[21]并略作修改。分別稱取經過預處理的5種樹脂各2 g于250 mL的錐形瓶中，后加入100 mL的樣品溶液（為確保試驗測定結果更加準確，以α-淀粉酶抑制率為參數時，樣品濃度為200 mg·L-1；以蔗糖酶抑制率為參數時，樣品濃度為10 mg·L-1。以麥芽糖酶和α-葡萄糖苷酶抑制率為參數時樣品濃度為40 mg·L-1）。將轉子放入錐形瓶中，打開磁力攪拌器，設定在100 r·min-1、30℃的條件下進行靜態吸附12 h。吸附結束后，測定溶液對4種糖苷酶的抑制率?；钚栽降蛣t說明樹脂吸附效果越好，選取對糖苷酶抑制率最低的樹脂進行接下來的試驗。

2.5 大孔吸附樹脂靜態吸附

2.5.1 吸附時間

稱取D101樹脂2 g于250 mL的錐形瓶中，加入100 mL樣品溶液，100 r·min-1、30℃的條件下靜態吸附12 h，最終達到飽和狀態。靜態吸附過程中，每間隔1 h，取樣測定4種糖苷酶抑制率。

2.5.2 吸附溫度

稱取D101樹脂2 g于250 mL的錐形瓶中，加入100 mL樣品溶液，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下靜態吸附3 h，測定吸附后溶液的4種糖苷酶抑制率。

2.5.3 樹脂質量

分別稱取D101樹脂1 g、2 g、3 g、4 g、5 g于250 mL的錐形瓶中，加入100 mL樣品溶液，在30℃條件下靜態吸附3 h，測定吸附后溶液的4種糖苷酶抑制率。

2.6 大孔吸附樹脂動態吸附

2.6.1 洗脫劑濃度

洗脫劑濃度確定根據參考文獻[22]并略作修改。稱取經過預處理的D101樹脂10 g裝柱（層析柱規格：1 cm×30 cm，1 BV=3.14×12×30/4≈25 mL），加入100 mL樣品溶液（pH 7），以2 BV·h-1的流速進行吸附，過柱后靜置2 h，然后依次選用各2 BV（50 mL）的蒸餾水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、100%乙醇進行洗脫。洗脫液用旋轉蒸發儀將乙醇完全蒸發，定容至100 mL，測定洗脫液的4種糖苷酶抑制率。

2.6.2 樣品溶液pH值

取5份100 mL樣品溶液，分別用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH將其pH調至4、5、6、7、8，然后稱取經過預處理的D101樹脂10 g裝柱5根，以2 BV·h-1的流速進行吸附，過柱后靜置2 h，2 BV（50 mL） 80%乙醇洗脫。洗脫液用旋轉蒸發儀將乙醇完全蒸發，定容至100 mL，測定洗脫液的4種糖苷酶抑制率。

2.6.3 洗脫劑用量

洗脫劑用量確定根據參考文獻[23]并略作修改。配制100 mL、pH 6的樣品溶液，稱取經過預處理的D101樹脂10 g裝柱2根，以2 BV·h-1的流速進行吸附，過柱后靜置2 h，然后量取100 mL（4 BV）80%乙醇進行洗脫，每25毫升（1 BV） 收集1份。洗脫液用旋轉蒸發儀將乙醇完全蒸發，定容至100 mL。測定洗脫液的蔗糖酶和α-葡萄糖苷酶抑制率；配制100 mL、pH 7的樣品溶液依法操作，測定洗脫液的麥芽糖酶和α-淀粉酶抑制率。

2.7 傅里葉變換紅外光譜分析

將樣品磨成粉末，與溴化鉀混合后一起壓片，得到均勻的薄片進行測試。掃描范圍為500 cm-1～4 000 cm-1。

3 結果分析

3.1 大孔吸附樹脂吸附條件的確定

3.1.1 大孔吸附樹脂篩選

將選取的5種大孔吸附樹脂進行靜態吸附，比較吸附后溶液對4種糖苷酶的抑制率，結果見圖1。

由圖1可知，經5種大孔吸附樹脂靜態吸附后，4種糖苷酶抑制率均有所下降，說明選取的大孔吸附樹脂對樣品中糖苷酶抑制劑都具有一定吸附作用，其中經D101樹脂吸附后樣品溶液的酶活性抑制率最低，說明D101樹脂的吸附效果最好，因此選用該樹脂。

3.1.2 吸附時間對樹脂吸附效果的影響

在靜態吸附過程中，通過吸附速率的高低可以確定吸附過程的最佳時間。D101樹脂吸附速率見圖2。

由圖2可得，4種糖苷酶的酶活性抑制率均在前2 h下降最快，3 h后基本沒有明顯變化，說明在3 h前吸附速率最快，在3 h后吸附率達到飽和。有效成分在大孔樹脂上的有效吸附通常分為4個連續的步驟[24]，前3 h下降很快，說明多糖成分的吸附主要是在暴露于表面的活性中心上，其只需要在溶液和液膜中進行擴散，到達樹脂表面即可吸附。而3 h以后，隨著吸附量的不斷增加，樹脂表面具有吸附活性的面積減少；多糖分子開始通過樹脂的孔道擴散到樹脂內表面而被吸附；樹脂顆粒內擴散的阻力限制了擴散，從而使得吸附趨于平緩直至達到飽和。

3.1.3 吸附溫度對樹脂吸附效果的影響

不同吸附溫度對羊肚菌水提物溶液糖苷酶抑制率的影響見圖3。

由圖3可知，吸附溫度對D101大孔樹脂吸附效果的影響較明顯，吸附后的溶液對4種糖苷酶抑制率均在30℃時最低。適當的提高溫度可以使得溶液的黏度降低，分子運動加快，從而可以有效提高多糖分子的擴散與吸附。

3.1.4 樹脂質量對樹脂吸附效果的影響

不同樹脂質量對羊肚菌水提物溶液糖苷酶抑制率的影響見圖4。

由圖4可知，樹脂質量對于樹脂吸附效果的影響較明顯，4種糖苷酶抑制率在樹脂質量不斷增加過程中，酶活性抑制率不斷降低。當樹脂質量為4 g后無明顯變化，說明吸附率達到飽和，即當樹脂質量與羊肚菌水提取物溶液的質量體積比為1∶25時，吸附效果最好。當樹脂量較少時，減少了多糖分子與樹脂接觸的機會，從而使得吸附量下降。

3.2 大孔吸附樹脂洗脫條件的確定

3.2.1 洗脫劑濃度的確定

不同濃度的洗脫劑對洗脫液糖苷酶抑制率的影響見圖5。

由圖5可知，隨著洗脫劑濃度的不斷增加，洗脫液糖苷酶抑制率也在遞增。當洗脫劑濃度為80%時，洗脫液中4種糖苷酶抑制率均為最高，洗脫效果最好。α-淀粉酶、麥芽糖酶、α-葡萄糖苷酶以及蔗糖酶抑制率分別為17.55%、14.81%、38.17%和46.2%。而洗脫劑濃度高于80%時，洗脫液對4種糖苷酶的抑制率則有所下降，由此可以確定洗脫劑乙醇的最佳濃度為80%。不同分子量大小的多糖在乙醇中的溶解度存在較大差異，并且對于非極性大孔樹脂而言，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強[25]。

3.2.2 羊肚菌水提物溶液pH的確定

樣品溶液的pH對洗脫液糖苷酶抑制率的影響見圖6。

由圖6可知，羊肚菌水提物溶液pH為7時，洗脫液α-淀粉酶酶與麥芽糖酶活性抑制率最高，分別為17.55%與14.81%。羊肚菌水提物溶液的pH為6時，洗脫液對α-葡萄糖苷酶與蔗糖酶酶活性抑制率最高，分別為41.95%與50.30%。由此可以確定不同的糖苷酶種類，羊肚菌水提物溶液分別在pH 6與pH 7時效果最佳。多糖分子中存在羥基，酸性過大的條件下容易質子化，削弱了與溶液中水分子的相互作用力，樹脂對多糖分子吸附力下降，從而導致洗脫液4種糖苷酶抑制率下降。而在堿性條件下，大孔樹脂容易結成塊狀物，也不利于樣品的吸附[26]。

3.2.3 洗脫劑用量的確定

不同洗脫劑體積對對洗脫液糖苷酶抑制率的影響見圖7。

由圖7可知，洗脫劑體積為2 BV時，洗脫液中α-淀粉酶與麥芽糖酶酶活性抑制率最高，分別為21.67%與16.02%；洗脫劑體積為3 BV時，洗脫液中α-葡萄糖苷酶與蔗糖酶酶活性抑制率最高，分別為42.23%與53.20%。由此可以確定根據糖苷酶種類的不同，洗脫劑乙醇的最佳用量分別為2 BV與3 BV。用量過少，洗脫不完全；而用量多，則易造成洗脫液中有效成分的濃度下降，從而降低其對4種糖苷酶的抑制率。

3.3 分離純化前后糖苷酶抑制率的比較

羊肚菌水提物中糖苷酶抑制劑分離純化前后對糖苷酶抑制率的比較見圖8。

由圖8可知，利用大孔吸附樹脂對羊肚菌水提物中糖苷酶抑制劑進行分離純化后，4種糖苷酶酶活性抑制率均有較大幅度提高。與分離純化前相比，α-淀粉酶酶活性抑制率由2.55%提高到21.67%，提高了8.50倍；麥芽糖酶抑制率由10.05%提高到16.02%，提高了1.59倍；α-葡萄糖苷酶酶活性抑制率由17.54%提高到42.23%，提高了2.41倍；蔗糖酶酶活性抑制率由43.80%提高到53.20%，提高了1.21倍。

3.4 分離純化前后樣品表征

羊肚菌水提物分離純化前后的傅里葉紅外光譜圖見圖9。

由圖9可知，羊肚菌水提物及其D101大孔樹脂洗脫物的紅外圖譜基本吻合，官能團種類基本未發生變化。在3 420 cm-1處出現-OH伸縮振動吸收峰，2 928 cm-1為C-H伸縮振動吸收峰，1 635 cm-1處出現-OH彎曲振動吸收峰，1 410 cm-1處出現=CH2的變形吸收峰，1 152 cm-1處出現環上C-O吸收峰，1 078 cm-1處出現了醇羥基的變角振動峰，1 026 cm-1處出現了糖環C-O-C吸收峰，926 cm-1處出現了呋喃環的對稱伸縮振動吸收峰，羊肚菌水提物及其洗脫物呈現明顯的多糖吸收特征。同時，850 cm-1處出現α型糖苷鍵的特征吸收峰，760 cm-1出現了振動吸收說明羊肚菌水提物及D101洗脫產物中具有吡喃糖結構,成苷的為α構型[27]。

4 結論與討論

選擇5種不同大孔吸附樹脂對羊肚菌水提物中的糖苷酶抑制劑的吸附效果進行研究，通過靜態吸附篩選出最佳樹脂為D101，確定吸附溫度為30℃，樣品溶液與樹脂比例為1∶25時吸附效果最好。D101大孔吸附樹脂對羊肚菌水提取物中α-淀粉酶及麥芽糖酶抑制物最佳分離純化條件是pH 7的樣品溶液吸附后，再以2 BV 80%乙醇洗脫；α-葡萄糖苷酶及蔗糖酶酶最佳分離純化條件是pH 6樣品溶液吸附后，再以3 BV 80%乙醇洗脫。純化后產物對α-淀粉酶、麥芽糖酶、α-葡萄糖苷酶以及蔗糖酶抑制率分別達到21.67%、16.02%、42.23%和53.20%，相比純化前提高了8.50倍、1.59倍、2.41倍與1.21倍。

目前，人們通過天然產物分離得到的糖苷酶抑制劑的純度普遍偏低，無法滿足生產所需[28]；所以選取一種操作簡便，效果顯著的純化方法具有重要意義。許有瑞等[29]曾利用有機溶劑萃取的方法分離甘草中α-葡萄糖苷酶抑制劑，經乙酸乙酯萃取后糖苷酶抑制率從69.77%提升至83.02%，僅提高了1.19倍。曾嵐等[30]曾利用大孔吸附樹脂分離甘草中α-葡萄糖苷酶抑制物，經處理后α-葡萄糖苷酶從48.11%提升至95.00%，提高了1.97倍。當前，天然糖苷酶抑制劑的研究開發已成為較活躍的領域，以淀粉、麥芽糖和蔗糖為底物的糖苷酶抑制劑定向篩選模式因其作用機制明確、靶向作用具體、假陽性率低等優點備受關注[31]。針對4種糖苷酶抑制劑所建立的大孔吸附樹脂的純化工藝合理可行，具有較好的純化效果，為羊肚菌水提物體外降血糖能力的研究與應用提供依據。