三相萃取法分離純化竹黃多糖工藝優化*

朱 煒，俞婷婷，計瑋瑋，黃 玲，鈕為民**

（1.湖州市生態林業保護研究中心，浙江 湖州 313000；2.湖州市梁希森林公園管理處，浙江 湖州 313000；3.湖州市國營林場，浙江 湖州 313000）

竹黃菌（Shiraia bambusicola P.Henn.）又名竹花、竹赤團子、竹三七、竹繭等，是一種寄生于竹子細嫩枝桿上的子囊菌[1]，其子座竹黃為傳統中藥，具有止咳祛痛、舒筋活絡、祛風利濕、補中益氣、活血補血、散瘀通經等功效[2]。竹黃菌主要分布于我國南部的江西、浙江、四川、湖南、安徽、貴州、福建、云南等地區[3]。竹黃多糖是竹黃的有效成分之一，近年來研究表明竹黃多糖具有良好的抗氧化性能和清除自由基能力，對小鼠的四氯化碳急性肝損傷具有保護作用，具有良好的開發利用價值[4]。

目前，多糖的傳統提取工藝為乙醇沉淀法，此方法雖然能提取出大量的多糖，但是存在提取不徹底、原料利用率低、乙醇用量大等問題[5]。三相萃取法原理是通過在粗提液中加入無機鹽和有機溶劑使其形成三相，上相為有機層，主要提取色素、脂類等極性較小的物質；中間相為蛋白質提取層；下相為水層，主要提取一些水溶性物質[6]。此外，體系中無機鹽和有機溶劑都可回收，且具有操作簡單、高效、體系容量大、可連續操作、條件溫和等特點[7-8]。三相分離法應用了傳統鹽析、共溶劑、等離子體和蛋白質滲透沉淀等多種原理，最近幾年才被用到多糖的分離純化中[9-10]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

竹黃子實體采自浙江省湖州市梅峰鎮短穗竹上；苯酚、硫酸、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鋁、無水乙醇、（NH4）2SO4、叔丁醇均為國產分析醇，購自國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白購于上海索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器

R-201旋轉蒸發器，上海申勝生物技術有限公司；20B型中藥粉碎機，南京邦斯特制藥設備有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海福瑪實驗設備有限公司；PL602-S電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2600紫外分光光度計，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 竹黃多糖提取液的制備

將10 g干燥的竹黃子實體粉碎后過40目篩，按料液比1∶40（g·mL-1）加入蒸餾水，90℃下水浴攪拌提取60 min；連續提取2次，過濾，合并2次濾液，濾液經50℃、真空旋轉蒸發儀濃縮至200 mL；濃縮液供三相萃取法分離多糖使用。

1.3.2 三相萃取體系

參照Yan等[10]的方法，取10 mL食用菌水提取濃縮液加入一定量的（NH4）2SO4，然后加入一定體積的叔丁醇配制所需三相體系。磁力攪拌10 min使兩相充分混勻，調節pH，以5 000 r·min-1離心10 min加速萃取劑分離過程，于一定溫度下靜置60 min，上相主要為叔丁醇，含有一些色素等雜質；中間相主要為蛋白質；下相主要是（NH4）2SO4和竹黃多糖[10]。使用移液器將三相各層的溶液分別吸出存于微量量筒中測定體積，后用水稀釋各相溶液，上相、中間相、下相檢測指標為蛋白質和多糖濃度。

1.3.3 萃取條件的單因素試驗

1）（NH4）2SO4添加量的確定

取5組各10 mL提取濃縮液，分別加入（NH4）2SO4使其質量濃度為10%、20%、30%、40%、50%后，再各加入15 mL叔丁醇（叔丁醇∶樣液體積比為1.5∶1）；在萃取溫度為25℃，pH 6的條件下萃取60 min；靜置2 h形成三相后，測定各相的相應指標，考察不同（NH4）2SO4質量分數對體系中多糖萃取率與蛋白質去除率的影響。

2）叔丁醇與樣液體積比的確定

吸取10 mL提取濃縮液于5組試管中，分別加入20%質量分數的（NH4）2SO4后，加入不同體積叔丁醇 （0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1）；在萃取溫度為25℃，pH 6的條件下萃取60 min，靜置2 h形成三相后，測定各相的相應指標；考察不同體積叔丁醇對體系中多糖萃取率與蛋白質去除率的影響。

3）萃取溫度的確定

吸取10 mL提取濃縮液于5組試管中，加入（NH4）2SO4，使其質量濃度為20%后加入15 mL的叔丁醇（叔丁醇∶樣液體積比為1.5∶1），在萃取溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，pH 6的條件下萃取60 min后測定各相的相應指標，考察不同萃取溫度對體系中多糖萃取率與蛋白質去除率的影響。

1.3.4 響應面法分析試驗

選擇萃取溫度、叔丁醇添加量、（NH4）2SO4質量分數3個因素所確定的水平范圍。運用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用3因素3水平的響應面設計。利用Design Expert 8.05軟件對試驗數據進行回歸分析。自變量的試驗水平分別以-1，0，1進行編碼，試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面分析因子及水平Tab.1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.5 分析方法

1）多糖萃取率的測定

采用苯酚-硫酸比色法[11]，制作葡萄糖標準曲線，在490 nm處測定樣品吸光度，通過純化前后樣品中多糖含量來確定多糖萃取率（M，%），計算公式為：

式中：C1為純化后提取液中多糖含量（g）；C2粗提液中多糖含量（g）。

2）蛋白質去除率的測定

采用考馬斯亮藍比色法[12]，制作牛血清蛋白標準曲線，在595 nm處測定樣品吸光度，通過純化前后樣品中蛋白質含量來確定蛋白質去除率（N，%），計算公式為：

式中：M1為純化后提取液中蛋白質含量（g）；M2粗提液中蛋白質含量（g）。

3） 數據處理

利用Design Expert 8.05軟件進行數據分析和處理[13]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 （NH4）2SO4質量分數對竹黃多糖萃取率和蛋白質去除率的影響

（NH4）2SO4質量分數對多糖萃取率及蛋白質去除率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著（NH4）2SO4添加量從10%增加到20%，多糖的萃取率增加，當（NH4）2SO4添加量為20%時，多糖的萃取率最大為87.50%。這可能是由于NH4+和SO42-可以穩定大分子間的相互作用，使萃取體系更加穩定，多糖能更好地溶解在溶劑中[10]；當（NH4）2SO4添加量超過20%，竹黃多糖的萃取量呈減少趨勢，可能由于鹽濃度過高會使多糖和水分子之間的氫鍵作用力被減弱，從而降低了多糖的萃取率。同時，隨著提取液中（NH4）2SO4添加量的增加，蛋白質去除率呈先上升后下降趨勢。在較低鹽濃度范圍內蛋白質去除率上升緩慢，當（NH4）2SO4添加量到達20%時，蛋白質去除率最高為84.81%，鹽離子在較低濃度時的“鹽溶”效應對相的分離有一定的促進作用；然而，隨著提取液中（NH4）2SO4添加量繼續增加，水分子被鹽離子吸引，從而產生強烈的鹽析效應[14]。因此提取液中最適（NH4）2SO4質量分數為 20%。

2.1.2 叔丁醇與樣液體積比對竹黃多糖萃取率及蛋白質去除率的影響

叔丁醇與樣液體積比對竹黃多糖萃取率及蛋白質去除率的影響見圖2。

由圖2可知，隨著叔丁醇添加量的增加，竹黃多糖的萃取率也相應增加，當叔丁醇與樣液體積比為0.5～1.0時，竹黃多糖萃取率增加幅度較大，在叔丁醇與樣液體積比為1∶1時竹黃多糖的萃取率最大為84.32%。這可能是增加的叔丁醇和（NH4）2SO4相互作用的結果，使多糖萃取率增加；但是當叔丁醇與樣液體積比超過1.0后，竹黃多糖的萃取率大幅下降，這可能是叔丁醇的含量過高不利于三相體系的穩定；可溶性蛋白質去除率隨叔丁醇的添加量增加而逐漸下降[15]，因此提取液中最適叔丁醇∶樣液體積比為 1∶1。

2.1.3 萃取溫度對竹黃多糖萃取率的影響

萃取溫度對竹黃多糖萃取率及蛋白質去除率的影響見圖3。

由圖3可知，當竹黃多糖萃取溫度自20℃升高至40℃，竹黃多糖的萃取率逐漸增大至83.70%，這可能是因為隨著溫度的升高大量的羥基暴露促進了更多的氫鍵或鏈接形成。三相萃取溶液體系中分子熱運動加快，從而使多糖的親水性增強，這樣竹黃多糖更容易從食用菌中進入到萃取溶液中，從而竹黃多糖的萃取率增加；當萃取溫超過40℃以后，竹黃多糖的萃取率出現下降。同時，隨著萃取溫度的增加，蛋白質去除率呈先上升后下降趨勢。當溫度為30℃時蛋白質萃取率最大為73.10%，因此綜合考慮選擇萃取溫度為40℃為宜。

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面試驗結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計3因素3水平的響應面分析試驗。選擇萃取溫度（A）、叔丁醇與樣液體積比（B）、（NH4）2SO4質量分數（C）作為自變量，以竹黃多糖萃取率作為響應值設計響應面試驗，結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及試驗結果Tab.2 Experiment design and results of response surface analysis

利用Design Expert 8.05軟件對表2試驗數據進行分析[13]，獲得多糖萃取率對萃取溫度、叔丁醇與樣液體積比和（NH4）2SO4質量分數的多元二次回歸方程，確定以多糖萃取率（P，%）為目標函數的二次多項回歸模型為：

對上述方程進行方差分析，見表3。

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis variance of regression model

由表3可知，以多糖萃取率為目標函數的回歸方程的回歸效果達到極顯著水平，P＜0.000 1；模型的決定系數R2為0.987 9，說明模型與實際試驗擬合較好；校正決定系數R2adj為0.972 4，說明該模型能解釋97.24%響應值的變化；模型的失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，表3中模型失擬項的P=0.333 6＞0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據表3的顯著性分析結果，叔丁醇添加量、萃取溫度對響應值影響顯著 （P＜0.05），（NH4）2SO4質量分數（C）、A2、B2、C2以及AC、BC的交互項對多糖萃取率的影響極顯著（P＜0.01）。各個因素對多糖萃取率影響大小順序依次為：（NH4）2SO4質量分數＞叔丁醇與樣液體積比＞萃取溫度。

2.2.2 響應面圖形分析

根據回歸方程作響應曲面圖，并根據擬合的響應曲面形狀，探討萃取溫度、叔丁醇添加量及（NH4）2SO4質量分數對竹黃多糖萃取率的影響。分別將萃取溫度、叔丁醇添加量及（NH4）2SO4質量分數的其中一個因素固定在0水平，得到另外2個因素的交互影響結果，二次回歸方程的響應面及其等高線見圖4～圖6。

從圖4～圖6可以看出，影響竹黃子實體多糖萃取率的最顯著因素為（NH4）2SO4質量分數，極值條件應該在等高線的圓心處，表現為響應面變化弧度較大。其次是叔丁醇與樣液體積比。萃取溫度響應面弧度變化平緩，說明其對響應值影響較小。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[16]。從圖4～圖6可以看出，叔丁醇與樣液體積比與（NH4）2SO4質量分數相互之間，萃取溫度與（NH4）2SO4質量分數相互之間對多糖萃取率有交互作用的影響。

2.3 驗證試驗

根據Box-Behnken試驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用Design-Expert 8.05分析，得到最佳提取條件為：萃取溫度35.16℃，叔丁醇∶樣液體積比為0.96∶1，（NH4）2SO4質量分數26.10%，多糖萃取率理論值可達93.51%。

為檢驗模型預測值與實際試驗值之間的相關性，即檢驗響應面優化模型的可靠性，對竹黃子實體中多糖萃取率進行試驗驗證。試驗中萃取溫度、叔丁醇∶樣液體積比和（NH4）2SO4質量分數的優化值分別為35.16℃，0.96∶1，26.10%。通過3次平行試驗，測得多糖萃取率分別為90.38%、90.25%、90.67%。實際多糖萃取率平均值為90.43%，達到了回歸模型預測理論值的96.70%。試驗結果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預測竹黃子實體多糖萃取率。

3 結論

以竹黃為原料進行試驗，利用三相萃取法分離純化竹黃多糖，考察叔丁醇-（NH4）2SO4-水提液體系的三相萃取性質，研究了三相體系中的提取液中（NH4）2SO4質量分數、叔丁醇添加量、萃取液溫度對竹黃提取液中多糖萃取率和蛋白質去除率的影響；在單因素試驗的基礎上，通過Box-Benhnken組合設計和響應曲面分析法優化了三相萃取的最優工藝。響應面分析結果表明，竹黃子實體中多糖的最佳提取條件為：萃取溫度35.16℃，叔丁醇∶樣液（體積）為0.96∶1，（NH4）2SO4質量分數26.10%，此條件下的多糖萃取率可得90.43%，蛋白質去除率可達88.45%。三相萃取體系中的無機鹽和有機溶劑都可以回收重復使用，三相萃取法分離純化竹黃活性成分是一種具有前景的高效分離方法。