基于網絡藥理學探討《時病論》春溫首方治療流行性感冒的作用機制

劉 毅,賈躍進

(1.山西中醫藥大學,山西 太原030024;2.山西中醫藥大學附屬醫院,山西 太原030024)

流行性感冒(簡稱流感)是一種因流感病毒引起并由空氣傳播的急性呼吸系統疾病,具有高度傳染性[1]。在20世紀曾發生3次流感大流行,造成大量人口死亡,目前每年仍呈季節性流行[2],威脅著全球人類健康安全[3]。研究認為,早期的抗病毒治療是治療流感的有效方法[4],而現代醫學仍缺乏相關的有效抗病毒藥物[5],因此挖掘中醫藥療法可為流感的治療提供一定的思路。《時病論》是清·雷豐所著的溫病學著作,本文所選用方劑為春溫首方,該方由防風、桔梗、陳皮、苦杏仁、淡豆豉、蔥白組成,功效為辛溫解表,可解寒傷于表,內有伏氣。現代藥理學研究認為,該方各組分有抗病毒、解熱鎮痛、抗炎、止咳、抗肺損傷等作用[6-11]。《流行性感冒診斷與治療指南》中認為輕癥中風寒束表為其重要證型[12],故用辛溫解表的春溫首方對癥治療。中藥治療具有整體性、多靶點、多通路的特點,體現了其復雜的網絡特質,因此網絡藥理學可為研究復雜中藥體系提供新思路[13]。本文使用網絡藥理學的方法分析《時病論》春溫首方治療流感的可行性與作用機制,以期為臨床治療提供參考。

1 方法

1.1 藥物活性成分與靶點搜集 利用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php),分別以春溫首方各藥物為關鍵詞檢索,并限定OB(oral bioavailability)≥30%,DL(drug-likeness)≥0.18,篩選出活性成分及對應靶點,并在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)中匹配基因名。

1.2 疾病靶點與藥物-疾病交集靶點獲取 以“influenza”為關鍵詞檢索GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/＃)數據庫,得到流感疾病靶點。將1.1中藥物活性成分靶點與疾病靶點取交集,并繪制Venn圖。

1.3 疾病-藥物-成分-靶點網絡及蛋白相互作用(PPI)網絡構建 分別取疾病、方劑、活性成分、靶點作為節點,邊為其關聯關系,借助CytoscapeV3.6.0構建網絡。另外,將1.2中交集靶點導入String數據庫(https://string-db.org/),構建PPI網絡并利用Cytoscape分析節點度(degree),篩選出核心靶點網絡。

1.4 GO(gene ontology)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析 借助Metascape(https://metascape.org/)平臺,將1.2中交集靶點分別進行GO生物過程、分子功能、細胞成分和KEGG通路富集分析,并利用在線作圖平臺ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制富集氣泡圖。

2 結果

2.1 藥物活性成分與靶點搜集結果 通過檢索TCMSP數據庫并限定藥物OB、DL值篩選活性成分,結果見表1。經查重排除后,春溫首方全方共搜集到45種活性成分,163個關聯靶點。

表1 春溫首方中活性成分基本信息

2.2 疾病靶點及藥物-疾病交集靶點獲取結果 檢索共獲得流感靶點480個。將2.1中163個藥物關聯靶點與其取交集,得到46個交集靶點。

2.3 疾病-藥物-成分-靶點網絡及蛋白質相互作用(PPI)網絡構建結果 使用Cytoscape構建疾病-方劑-藥物-成分-靶點網絡,得到214個節點、637條邊。分析可得知節點度較大(Degree＞二倍中位數)的關鍵活性成分有7種:木犀草素(luteolin)、漢黃芩素(wogonin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、川陳皮素(nobiletin)、刺槐素(acacetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。利用String獲取PPI網絡,其中節點表示靶點,邊為蛋白互作關系,圖中有46個節點、454條連線,平均節點度為19.4。再用Cytoscape分析PPI網絡,并選取節點度＞27者為核心靶點,共得出8個核心靶點。

2.4 GO和KEGG通路富集分析結果 利用Metascape將交集靶點進行GO、KEGG通路富集分析。其中GO生物過程、分子功能、細胞成分分別獲得1 028、52、31條結果;KEGG通路富集分析得出133條結果。然后設定P值＜0.01,最小計數為3,富集因子＞1.5,分別取其前20、10、7、16的富集項,繪制富集氣泡圖。結果可見:GO生物過程主要為細胞因子介導的信號通路、對細胞因子產生的積極調節、分化白細胞、活化T細胞等;GO分子功能主要有細胞因子受體結合等;GO細胞成分主要涉及膜筏等;KEGG通路主要包括AGERAGE信號通路、HIF-1信號通路、瘧疾、NF-κB信號通路、HTLV-I感染、單純皰疹感染、JAK-STAT信號通路等。

3 討論

流感屬中醫“疫病”范疇,也稱“時行感冒”。《黃帝內經》載:“五疫之至,皆相染易,無問大小,病狀相似。”[14]描述了疫病的發病特點。張仲景則將疫病統歸于傷寒[15]。《溫疫論》曰:“溫疫之為病,非風,非寒,非濕,乃天地間別有一種異氣所感。”[16]闡釋了疫病的病因。吳瑭揭諸溫之大綱,細致劃分疫病,認為三焦各自“有風溫、有溫熱、有溫疫、有溫毒、有暑溫、有濕溫、有秋燥、有冬溫、有溫瘧”[17]。因此,中醫對該類疾病有較深刻的認識。

本研究所得46個交集靶點與45種活性成分相關,可見各藥物成分間有協同作用。分析疾病-藥物-成分-靶點網絡所得的關鍵活性成分,其中山柰酚是存在于多種植物中的天然黃酮醇,研究認為其可抑制炎性細胞功能,并抑制促炎細胞因子和趨化因子,從而發揮抗炎作用[18];木犀草素可通過AKT/Nrf2和NF-κB途徑對小鼠肺損傷有保護作用[19],研究證實其在體內和體外均有較強的抗炎活性[20],主要通過包括核因子(NF)-κB途徑中的Src、激活蛋白(AP)-1途徑中的MAPK發揮作用;黃芩素可通過調節AMPK激活表現有效抗流感活性[21],同時其具有防止小鼠急性肺損傷和炎癥的效果[22]。根據PPI所得的核心靶點,大致可分為半胱天冬酶(CASP3)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK3、MAPK1、MAPK8、MAPK14)、白介素(IL-6、IL-10)和前列腺素G/H合酶(PTGS2)。

通過GO和KEGG通路富集分析,得知春溫首方干預流感的主要生物過程及主要通路,其中生物過程多為免疫反應過程;通路中HTLV、單純皰疹為病毒感染,與流感發病原因相似;而與以上通路關聯較多的靶點為IL-6,IL-6是有多種生物學功能的細胞因子,是急性期炎癥反應的有效誘導劑,與B細胞、淋巴細胞和單核細胞的分化有關[23]。研究顯示,流感的炎癥反應產生IL-6,而抑制IL-6在許多炎性疾病包括病毒感染中具有治療作用[24]。另外,HIF-1信號通路在感染中起到重要作用[25]。NF-κB信號通路是先天性和適應性免疫反應的關鍵之一[26]。JAK-STAT信號通路則是與涉及自身免疫和炎性疾病發病機制的細胞因子相關的通路[27]。

綜上所述,通過中醫理論、網絡藥理學和分子層面的研究,本文初步揭示了《時病論》春溫首方通過“多成分、多靶點、多通路”治療流感的可行性,以及在抗病毒、抗炎、調節免疫等方面發揮作用的相關機制,為臨床應用中藥治療流感和進一步研究提供理論參考。