川楝素通過下調環狀RNA circDLST 對胃癌細胞BGC-823 的抑制作用

張 靖

上海交通大學附屬第六人民醫院消化科，上海 200233

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，盡管全球胃癌的發生率和死亡率呈下降趨勢[1]，但在我國胃癌仍位居惡性腫瘤死因的第3 位[2]。傳統中醫藥在抗腫瘤轉移和復發、改善患者生活質量等方面也具有一定的作用。川楝素（toosendanin，TSN）是川楝樹根皮及川楝子的有效提取物，具有多種生物學效應，包括抗腫瘤作用，抑制多種腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡[3-5]。我們前期研究[3-4]發現，TSN 可以通過阻斷蛋白激酶B（protein kinase B，PKB 或AKT）/ 糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）信號通路抑制胃腸腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡，增強腫瘤細胞化學治療（化療）敏感性。

環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種共價閉合環狀結構的非編碼RNA，廣泛存在于各種生物細胞中，它是由前體線性RNA 反向剪接產生，具有結構穩定、序列保守和組織特異性等特征[6]。circRNA 與胃癌密切相關：circ_0047905、circ_0138960 和circ_7690-15 在胃癌組織中高表達，促進胃癌細胞的增殖和侵襲能力[7]；circ_100269通過靶向miR-630 抑制胃癌增殖[8]；circDONSON 通過核小體重構因子（nucleosome remodeling factor，NURF）復合物依賴的SOX4（SRY-related HMG box transcription factor 4）激活促進胃癌生長和侵襲[9]；circLARP4 通過吸附miR-424-5p 激活大腫瘤抑制激酶1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1） 抑 制 胃 癌 侵 襲 作 用[10]；circDLST 通 過 吸 附miR-502-5p 和 激 活NRAS（NRAS proto-oncogene，GTPase）/MEK1（mitogen-activated protein kinase kinase 1）/ERK1/2（mitogen-activated protein kinase 1/2）信號促進胃癌生長和侵襲[11]。我們利用TSN處理組和對照組篩選差異表達的circRNA，發現TSN 明顯調控circDLST。本研究旨在通過觀察TSN 對circDLST表達及胃癌生長的影響，為胃癌治療提供潛在的策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑和儀器 TSN（純度≥99%）購自上海源業生物科技有限公司，噻唑藍（MTT）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司（南京），TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司，circDLST 過表達及其空載對照慢病毒載體購自上海吉凱生物科技有限公司，反轉錄試劑盒和SYBR Green Master Mixture 購 自 日 本TaKaRa 公 司，Transwell 試劑盒購自美國BD 公司。實時熒光定量PCR儀購自美國Kray Technologies 公司，酶標分析儀（型號BS-1101）購自美國Bio-Rad 公司。

1.1.2 胃癌細胞系 人胃癌細胞系BGC-823 購自上海中國科學院細胞庫。

1.1.3 實 驗 動 物 雄 性BALB/c 裸 鼠（4 ～5 周 齡，18 ～20 g）購自中國科學院上海生命科學研究院上海斯萊克實驗動物責任有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005。裸鼠飼養于上海市第六人民醫院動物實驗室，SPF 級飼養，帶有密封空氣過濾裝置的塑料籠，實驗動物使用許可證號為SYXK（滬）2016-0020。

1.2 實驗方法

1.2.1 定量PCR 用不同濃度TSN（0、0.5、1.0 和2.0 μmol/L） 處理胃癌細胞BGC-823 24 h 后，TRIzol 提取總RNA，并通過M-MLV 反轉錄酶合成cDNA，使用SYBR Green Master Mixture 試劑盒進行cDNA 擴增。circDLST 上、下游引物序列分別為5'-TACAGTCAAAACCCCAGCGT-3'和5'-GTTGTTAATGCTTTCTCCCACC-3'。 以 人β 肌 動蛋白（β-actin）為內參對照，上、下游引物序列分別為5'- GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3'和5'-CCTGTAAC AACGCATCTCATATT-3'。每個樣品重復3 次。

1.2.2 MTT 增殖實驗 將circDLST 過表達及其空載對照（CON）慢病毒載體轉染胃癌細胞BGC-823，具體轉染方法參考文獻[11]。細胞在96 孔培養板中培養，密度為5×103/孔。細胞貼壁48 h 后，以0.5 μmol/L TSN 處理細胞。每隔24 h 分析細胞增殖活性，加入20 μL MTT（5 mg/mL）孵育4 h 后，加入150 μL 二甲基亞砜溶解5 min，使用酶標分析儀在570 nm 處檢測吸光度值。實驗分為circDLST+TSN組、CON+TSN 組和CON+PBS 組，重復3 次。

1.2.3 Transwell 侵襲實驗 將circDLST 過表達及其空載對照慢病毒載體轉染胃癌細胞BGC-823，細胞貼壁48 h后，以0.5 μmol/L TSN 處理細胞24 h。使細胞懸浮在無血清培養基中饑餓24 h 后，將懸浮細胞添加到含有基質凝膠（3.9 μg/μL）的上層小室；而下層小室含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基。最后穿過凝膠的細胞用75%乙醇固定，并用結晶紫進行染色。光學顯微鏡下對每組挑選3 個視野進行細胞計數，實驗分為circDLST+TSN 組、CON+TSN 組和CON+PBS 組，重復3 次。

1.2.4 裸鼠皮下移植瘤模型建立 將circDLST 過表達及其空載對照慢病毒載體轉染胃癌細胞BGC-823 后，皮下注射接種（1×107/只），建立裸鼠皮下移植瘤動物模型。12 d 后，將模型裸鼠隨機分為3 組：circDLST+TSN 組（n=6），circDLST 轉染的胃癌細胞BGC-823 建立裸鼠皮下移植瘤后，每日腹腔注射200 μg/kg TSN[3]；CON+TSN組（n=6），CON 轉染的胃癌細胞BGC-823 建立裸鼠皮下移植瘤后，每日腹腔注射200 μg/kg TSN；CON+PBS 組（n=6），CON 轉染的胃癌細胞BGC-823 建立裸鼠皮下移植瘤后，每日腹腔注射等量的PBS。每隔1 日用游標卡尺測量裸鼠皮下腫瘤的長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積V=1/2ab2。注射32 d 后處死各組裸鼠。動物研究獲得上海交通大學附屬第六人民醫院動物實驗室的倫理許可。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TSN 對胃癌細胞中circDLST 表達的影響

利用不同濃度TSN（0、0.5、1.0 和2.0 μmol/L）處理胃癌細胞24 h 后，定量PCR 結果（圖1）顯示，與對照組（0 μmol/L）比較，TSN 明顯下調circDLST 的表達水平，且呈濃度依賴性（均P＜0.01）。

2.2 TSN 通過調節circDLST 對胃癌細胞增殖活性的影響

之前的研究[11]已報道circDLST 過表達載體在BGC-823 胃癌細胞具有高的轉染效率。circDLST 過表達載體或空載體轉染胃癌細胞后，以0.5 μmol/L TSN 處理。MTT增殖實驗結果（圖2）顯示，與CON+PBS 組比較，TSN作用72 h 后可顯著抑制胃癌細胞增殖活性（均P=0.000）；而與CON+TSN 組比較，過表達circDLST 可逆轉TSN 抗胃癌細胞增殖活性的作用（P=0.000）。

圖2 circDLST 對TSN 抗胃癌細胞增殖活性的逆轉效果Fig 2 Reverse effect of circDLST on the anti-proliferation activity of TSN in gastric cancer cells

2.3 TSN 通過調節circDLST 對胃癌細胞侵襲能力的影響

Transwell 侵襲實驗（圖3）顯示，與CON+PBS 組比較，TSN 可顯著抑制胃癌細胞的侵襲能力（P=0.000）；而與CON+TSN 組比較，過表達circDLST 可逆轉TSN 抗胃癌細胞侵襲能力的作用（P=0.000）。

圖3 circDLST 對TSN 抗胃癌細胞侵襲能力的逆轉效果Fig 3 Reverse effect of circDLST on the anti-invasion potential of TSN in gastric cancer cells

2.4 TSN 通過調節circDLST 對胃癌皮下移植瘤生長的影響

circDLST 過表達載體或空載體轉染BGC-823 細胞后皮下注射裸鼠，然后每日腹腔注射TSN 或PBS。結果（圖4）顯示，注射32 d 后，與CON+PBS 組比較，TSN可顯著抑制胃癌細胞皮下移植瘤的生長（P=0.000）；而與CON+TSN 組比較，過表達circDLST 可逆轉TSN 抗胃癌皮下移植瘤生長的作用（P=0.020）。

圖4 circDLST 對TSN 抗胃癌皮下移植瘤生長的逆轉效果Fig 4 Reverse effect of circDLST on the anti-xenograft tumor growth of TSN in gastric cancer cells

3 討論

腫瘤侵襲轉移是導致胃癌患者不良預后的主要原因之一。最近研究[12]顯示，circRNA 異常表達與胃癌生存、轉移及不良預后密切相關。circRNA 主要包括外顯子circRNA、外顯子內含子circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）和內含子circRNA，其中外顯子circRNA 占絕大多數。circRNA 的環狀結構賦予了它們獨特的生物學特性，如穩定性較強。circRNA 還能與miRNA 及蛋白質競爭性結合，參與蛋白質編碼和轉錄調節[13]。研究[10-13]發現，circ-102958、circ-0000520、circ-0001017 可能對早期胃癌具有潛在的診斷價值；circLARP4、circPSMC3、circDLST的異常表達與胃癌的發生發展密切相關。我們前期研究[11]亦發現，circDLST 作為外顯子circRNA 主要定位在胃癌細胞的細胞質，其異常上調可促進胃癌細胞的侵襲轉移，并與患者的不良預后相關，提示其可能成為判斷胃癌患者預后的潛在標志物。

本研究發現，不同濃度TSN 對胃癌細胞中circDLST表達具有抑制作用；同時TSN 可抑制胃癌細胞增殖活性、侵襲潛能和皮下移植瘤生長，而過表達circDLST 對TSN 的抗腫瘤效果具有逆轉作用。因此，提示TSN 可能通過下調circDLST 抑制胃癌細胞增殖和侵襲；但是TSN對circDLST 下游的miRNA 及信號通路的調節作用仍有待進一步的探究，以期為其抗胃癌作用提供更多的實驗 依據。

參·考·文·獻

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