lnc-MTBP-5 在結直腸癌中的表達及其對細胞侵襲能力的影響

嚴宇青，沈超琴，陳豪燕，洪 潔，王震華

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化科，上海市消化疾病研究所，上海 200001

研究[1-2]顯示，結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發病率及病死率分別位居惡性腫瘤的第3、4 位，是常見的消化系統惡性腫瘤，也是導致癌癥死亡的第二大病因。CRC 患者的死亡與病灶轉移密切相關，據統計患者因轉移而發生死亡的數量分別占初診和確診人數的25%和50%[3]。對于CRC 轉移的患者，切除原發灶和轉移灶是最佳的治療方案，但由于癌癥細胞的潛伏性、播散性和抗藥性，患者于術后復發十分常見[4]。因此，對CRC 轉移的具體機制及其診治標志物的研究，已成為當前關注的焦點。

在人類基因組中，細胞僅利用其中的2%來產生具有蛋白質編碼功能的轉錄本，其余大部分不編碼蛋白質的基因則被轉錄為非編碼RNA。其中，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是長度大于200 個核苷酸的非編碼轉錄本[5]。lncRNA 可定位在胞核內或胞質中。在分子水平上，lncRNA 通過不同機制調節染色質組成、基因轉錄和轉錄后修飾[6]。在許多腫瘤尤其是惡性腫瘤中，如胃癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌等[7-10]，lncRNA 的表達可發生改變。

基于此，我們假設有特定lncRNA 參與CRC 的轉移，通過篩選CRC 相關的lnc-MTBP-5，就該lncRNA 對人CRC 細胞侵襲能力的影響進行檢測，以期為CRC 的早期診斷及治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 數據收集

1.1.1 數據集獲取 從SRA（Sequence ReadArchive）數據庫中提取PRJNA218851 數據集和PRJNA376161 數據集。前者包括18 例CRC 患者的正常結腸黏膜、CRC 原發灶及肝轉移灶的數據，后者包括10 對腫瘤組織和正常結腸組織、5 對異常隱窩灶和匹配普通隱窩灶的數據。SRA數據庫信息均采用R3.5.2 軟件提取，用以篩選與CRC 轉移相關的lncRNA。

1.1.2 組織芯片數據獲取 在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中提取含有638 例CRC 組織芯片和51 例正常結直腸組織芯片的數據，分析lnc-MTBP-5在正常結直腸組織和CRC 組織中的表達差異。根據lnc-MTBP-5在CRC 患者癌組織表達量的中位數，將TCGA 數據庫中的638 例患者分為lnc-MTBP-5高表達組和lnc-MTBP-5低表達組。從TCGA 數據庫中提取CRC 患者的臨床信息，包括初次病理診斷年齡、性別、美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）臨床分級、淋巴結轉移、遠處轉移、脈管侵及、結腸息肉病史和治療后復發，分析lnc-MTBP-5與患者臨床預后的相關性。TCGA 數據庫CRC 組織芯片信息均采用R3.5.2軟件提取。

1.2 標本收集

選擇2016 年1 月—2017 年12 月于上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院的53 例CRC 手術患者，從癌組織和癌旁組織獲取標本，并于-80 ℃長期保存。本研究經上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院倫理委員會批準（倫理審批號為[2015]097），所有參與者均簽署了知情同意書。

1.3 細胞和主要試劑

人正常結直腸黏膜FHC 細胞以及人CRC 細胞HT29、SW480、DLD1、HCT116、SW1116、Lovo、RKO 和Caco2 均購自美國模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

RPMI-1640 培養液、McCoy's 5A 培養液、OptiMEM培養液和胎牛血清均購自美國Gibco 公司，DharmaFECT 1 轉染試劑購自美國GE Healthcare 公司，RNAiso Plus、反轉錄試劑和實時熒光定量PCR 試劑盒均購自日本TaKaRa公司，PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，CCK-8 檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所，Transwell 小室購自美國Millipore 公司，Matrigel 膠購自美國BD Bioscience 公司。

1.4 CRC 細胞培養及轉染實驗

分別采用含5%胎牛血清的McCoy's 5A 完全培養基和RPMI-1640 完全培養基，于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養HT29、SW480 細胞，于3 d 后傳代。待細胞生長至指數生長期時，分別以3×105個/孔、2×105個/孔接種于6 孔板中，用于后續轉染。

用Control siRNA、lnc-MTBP-5siRNA 分 別 轉 染HT29 和SW480 細胞，并用正常表達lnc-MTBP-5的質粒（pcDNA3.1）、lnc-MTBP-5過表達質粒（pcDNA3.1-lnc-MTBP-5）分別轉染SW480 細胞。于6 孔板中繼續分別培養上述細胞24 h 后，將培養液更換為無血清培養基。于37 ℃培養6 h 后將培養基更換為完全培養基，繼續培養細胞48 h 后提取RNA，用于后續研究。轉染實驗siRNA 序列見表1。

表1 siRNA 序列Tab 1 Sequence of siRNA

1.5 細胞和組織中lnc-MTBP-5 的表達量檢測

采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測lnc-MTBP-5的表達量。采用磷酸鹽緩沖液洗滌FHC 細胞、8 種CRC 細胞及轉染的HT29、SW480 細胞各2 次，同時將53 例結直腸癌組織和癌旁組織標本研磨成粉末后，按照操作說明抽提總RNA。細胞質/細胞核RNA 抽提按照試劑盒說明操作。分別取1 μg 上述RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit 試劑盒反轉錄成cDNA，并以此為模板用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒、StepOne real-time PCR 系統進行qPCR 檢測。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個循環。以2-△△CT值評估基因的相對表達量，每組實驗設置3 個復孔。細胞、組織中總表達量的檢測以GAPDH為相對內參，細胞質和細胞核內表達量檢測以U6為相對內參。引物序列見表2。

表2 PCR 引物序列Tab 2 Primer sequences for PCR

1.6 細胞增殖能力檢測

采用CCK8 實驗檢測CRC 細胞的增殖能力。將HT29、SW480 細胞接種至96 孔板中，按1.4 方法分別轉染Control siRNA 和lnc-MTBP-5siRNA。分別在轉染后的第0、1、2、3、4 日，向每孔加入100 μL 含10% CCK8試劑的無血清培養基，于37 ℃孵育2 h 后，用酶標儀測定樣品在450 nm 處的吸光度。

1.7 細胞克隆形成能力檢測

采用克隆形成實驗檢測CRC 細胞的增殖能力。將HT29、SW480 細胞以800 個/孔接種至6 孔板中，按1.4方法分別轉染Control siRNA 和lnc-MTBP-5siRNA，并靜置于培養箱中。7 d 后棄去培養基，經固定染色后拍照，觀察克隆形成的大小和數量。

1.8 細胞侵襲能力檢測

采用侵襲實驗檢測SW480 細胞的侵襲能力。將SW480 細胞按2×105個/孔接種于6 孔培養板中，培養24 h 后向其中分別轉染Control siRNA 和lnc-MTBP-5siRNA，以及對照質粒和lnc-MTBP-5過表達質粒。繼續培養24 h 后進行消化，并用無血清RPMI-1640 培養液重懸細胞。在24 孔培養板中放入Transwell 小室，鋪入40 μL Matrigel；4 ～6 h 后向小室下層加入600 μL 含20%胎牛血清的RPMI-1640 培養液，小室上層加入200 μL 上述4 組細胞懸液。繼續培養48 h 后取出小室，固定染色并于光學顯微鏡下進行觀察。隨機選取4 個視野（放大倍數為40 倍），計數穿過Matrigel 的細胞數，取平均值。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對研究數據進行統計分析，所有實驗均重復3 次。組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SRA 數據庫中與CRC 轉移相關的lncRNA 分析

采用t檢驗對PRJNA218851 數據集進行分析，共獲得105 條[假發現率（false discovery rate，FDR）＜0.05）]在正常-原發灶-轉移灶中依次表達上調的lncRNA；在PRJNA376161 數據集中，對10 對腫瘤組織和癌旁正常組織的數據分析得到990 條（FDR＜0.05）差異表達lncRNA。對上述lncRNA 取交集，共得到10 條在2 個數據集中均有意義的lncRNA。通過在UCSC（http://genome.ucsc.edu/）中比對序列，我們將關注點放在ENSG00000254814、ENSG00000257453 和ENSG00000272502 這3 條lncRNA上，篩選流程如圖1A。由于前2 條lncRNA 的引物未能成功合成，因此僅重點研究ENSG00000272502。通過在LNCipedia 數據庫（https://lncipedia.org/）中對該lncRNA的編碼潛能進行驗證（排除假陽性），最終確認其（lnc-MTBP-5）是一種非編碼RNA（圖1B）。

在正常腸上皮細胞和8 個結直腸癌細胞系中對lnc-MTBP-5表達量進行檢測，結果顯示lnc-MTBP-5在5 個結直腸癌細胞中的表達均顯著高于FHC 細胞（圖1C）。通過對HT29、SW480 細胞的胞質和胞核RNA 進行分離發現，lnc-MTBP-5在胞質、胞核中均有分布（圖1D、E）。

圖1 SRA 數據庫中與CRC 轉移相關的lncRNA 分析Fig 1 Analysis of lncRNAs related to CRC metastasis in SRA database

2.2 lnc-MTBP-5 在CRC 患者癌組織和癌旁組織中的表達差異

為了探討lnc-MTBP-5與CRC 的臨床相關性，本研究對53 例結直腸癌組織和癌旁組織標本中lnc-MTBP-5的表達進行檢測，結果（圖2A）顯示癌組織中lnc-MTBP-5的表達顯著高于癌旁組織（P=0.000）。進一步針對TCGA數據庫中638 例癌組織和51 例正常組織中的lnc-MTBP-5表達進行評估，結果（圖2B）顯示癌組織中其表達高于正常組織（P=0.000）。繼而提示，lnc-MTBP-5的高表達可能參與了CRC 的發生和發展。

2.3 CRC 組織中lnc-MTBP-5 表達與患者臨床預后的關系

為進一步驗證lnc-MTBP-5與CRC 的臨床相關性，本研究發現在TCGA 數據庫的638 例患者中，lnc-MTBP-5表達的高低與患者的初次病理診斷年齡（P=0.020）、臨床分期（P=0.006）、淋巴結轉移情況（P=0.017）、遠處轉移情況（P=0.033）有關（表3）；且與低表達組相比，lnc-MTBP-5高表達組中初次病理確診年齡小于65 歲以及臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的患者居多，且易發生淋巴結轉移和遠處轉移。

圖 2 lnc-MTBP-5 在正常結直腸組織與CRC 組織中的表達Fig 2 Expressions of lnc-MTBP-5 in CRC tissues and normal colorectal tissues

表3 CRC 患者中lnc-MTBP-5 表達與臨床信息的關系Tab 3 Relationship between lnc-MTBP-5 expression and clinical information in patients with CRC

2.4 lnc-MTBP-5 對CRC 細胞侵襲能力的影響

為評估lnc-MTBP-5在CRC 發生與發展中的生物學功能，本研究通過向HT29、SW480 細胞中轉染lnc-MTBP-5siRNA 發現，lnc-MTBP-5的表達量顯著下降；而在SW480細胞中轉染pcDNA3.1-lnc-MTBP-5后發現，lnc-MTBP-5的表達量顯著升高（圖3A ～C）。隨后，進一步開展功能實驗發現，在HT29 和SW480 細胞中轉染lnc-MTBP-5siRNA后，與轉染Control siRNA 的細胞相比，前者的增殖和克隆形成能力無明顯差異（圖3D、E）。因HT29 是高分化型CRC 細胞系，侵襲能力較弱，侵襲功能實驗僅選擇低分化的SW480 細胞系進行。侵襲實驗結果表明，經lncRNA siRNA 轉染的SW480 細胞穿過Transwell 小室的數量少于經Control siRNA 轉染的細胞（圖3F）。相反，與轉染對照質粒的SW480 細胞相比，上調lnc-MTBP-5后，SW480 細胞侵襲能力增強（圖 3G）。以上結果表明，lnc-MTBP-5可以增強SW480 細胞的侵襲能力，但對HT29 和SW480 細胞的增殖和克隆形成能力無明顯影響。

2.5 lnc-MTBP-5 與轉移起始基因表達的相關性

轉移起始基因的缺失或過表達均能促使細胞外基質的降解、細胞黏附的減少、細胞侵襲能力的增強、血管生成以及腫瘤微環境的改變[11]。為進一步探索lnc-MTBP-5的作用機制，本研究對TCGA 數據庫中lnc-MTBP-5的表達與轉移起始基因的表達做相關性分析。結果（圖4）顯示，lnc-MTBP-5與結腸癌轉移相關因子1（metastasis associated in colon cancer 1，MACC1）呈正相關；經進一步探索其下游機制發現，lnc-MTBP-5與間質上皮轉換因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）、鈣黏著蛋白關聯蛋白（cadherin-associated protein，CTNNB1）均呈正相關，而與肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）均無明顯正相關性。繼而提示，lnc-MTBP-5促進CRC 的轉移可能與MACC1 激活HGF/MET 通路及其下游AKT/CTNNB1 通路有關。

圖3 lnc-MTBP-5 在CRC 發生與發展中的生物學功能Fig 3 Biological function of lnc-MTBP-5 in the occurrence and development of CRC

圖4 lnc-MTBP-5 與轉移相關基因表達的相關性分析Fig 4 Correlation analysis of lnc-MTBP-5 and the expression of metastasis associated genes

3 討論

研究[12-13]顯示，CRC 的發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，且其病灶轉移是CRC 患者死亡的主要原因。因此，針對CRC 轉移的早期檢測，并尋找有效的分子標志物成為近年來預防和治療CRC 的關鍵點。

已有研究報道，CRC 的轉移與許多分子標志物相關，如JMJD2C、FOXC1、SGK1、RHBDD1[14-17]。同時，非編碼RNA 也被廣泛報道參與了CRC 轉移的發生。依據RNA 長度的不同，非編碼RNA 被分為兩類；其中，小于200 個核苷酸的轉錄本被稱為microRNA，通常在轉錄后調節基因的表達；而大于200 個核苷酸的轉錄本被稱為lncRNA，該類RNA 具有較強的組織和細胞表達特異性，參與調節多種重要的細胞活動，如募集染色質修飾物（HOTAIR）[18]、調節X 染色體基因表達（XIST）[19]、調節基因組表達和蛋白質活性等。此外，lncRNA 還具有結構相對穩定，易于在血液和尿液中被檢測，且定量方法靈敏、快速、成本低廉等優勢[20]，使得該類RNA 可作為癌癥初篩、早期診治的分子標志物，具有較強的應用價值。

在本研究中，通過整合分析2 個SRA 數據集的數據，篩選出在正常-原發灶-轉移灶中表達依次上調的lncRNA，通過結合文獻以及細胞實驗、臨床標本信息的驗證，我們選擇了lnc-MTBP-5繼續研究；結果顯示，該lncRNA 在多個CRC 細胞系和CRC 組織中均呈高表達。同時，本研究通過提取TCGA 數據庫中CRC 患者的臨床信息進行研究，結果顯示lnc-MTBP-5的表達量與患者預后緊密相關。繼而推測，lnc-MTBP-5或可作為早期預警和診斷CRC 的分子標志物；由于高表達lnc-MTBP-5的患者易發生CRC 轉移，臨床醫師應在患者早期給予積極治療，手術后密切隨訪。

CRC 的肝轉移是影響患者預后的重要危險因素之一，因此揭示CRC 轉移的發生機制亦是改善患者預后的關鍵點。本研究通過下調lnc-MTBP-5的表達發現，SW480 細胞的侵襲能力減弱，繼而證實lnc-MTBP-5的高表達可提高CRC 的轉移能力。

先前已有研究表明lncRNA 在CRC 中呈現異常表達，但有關其在CRC 轉移中的作用及機制仍知之甚少。目前，基于lncRNA 在序列、結構以及生物功能上的高度異質性，存在有多種lncRNA 的分類方法，如根據亞細胞定位可將lncRNA 分為細胞核lncRNA 與細胞質lncRNA。lncRNA 的亞細胞定位與其功能密切相關，如在細胞質中lncRNA 可作為競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與microRNA 競爭性結合，調節miRNA抑制的靶基因表達[21]。已有研究[22]報道，lncRNAUICLM通過競爭性結合miR-215 來調節其下游ZEB2的表達，進而促進CRC 的肝轉移。lncRNAXIST可直接結合miR-200b-3p，調節其下游ZEB1的表達，從而促進CRC 細胞的增殖、侵襲、上皮間充質轉化及小鼠模型中腫瘤的生長和轉移[23]。考慮到本研究中lnc-MTBP-5在胞質、胞核均有分布，我們推測lnc-MTBP-5可通過競爭性結合相關microRNA，調節下游靶基因的表達，促進CRC 的轉移。

癌癥的轉移是一個復雜的過程，包括細胞外基質的降解、細胞黏附性的降低、癌細胞的黏附性增加和腫瘤微環境的改變等[24-28]，是許多腫瘤發展、侵襲的重要過程[29-30]。根據在轉移中所起的作用，與轉移相關的基因可分為促癌基因、轉移起始基因、轉移進展基因和轉移毒力基因[11]。轉移起始基因MACC1已被證實在惡性腫瘤組織中有較高的表達，尤其在發生轉移的惡性組織中。MACC1可通過結合Met的啟動子區，激活HGF/MET 通路，進而促進腫瘤的增殖、上皮間質轉化、血管生成、侵襲轉移、調節細胞代謝和凋亡[31-32]。HGF/MET 通路的激活可使其下游的相應信號通路被激活，如通過TWIST/VEGF 通路促進血管生成，激活Nanog 分子增強細胞干性，激活STAT1/3、MCL1/FAS調節細胞凋亡和免疫重建。其中，AKT/CTNNB1 通路是HGF/MET 通路促進腫瘤轉移的中間信號通路。本研究初步分析了TCGA 數據庫中lnc-MTBP-5與轉移相關基因表達的相關性，并發現lnc-MTBP-5促進CRC 的轉移可能與MACC1 激活HGF/MET通路及其下游AKT/CTNNB1 通路有關。結合lnc-MTBP-5在胞質、胞核的分布，我們推測lnc-MTBP-5可能通過競爭性結合microRNA 提高MACC1 的表達，進而激活下游AKT/CTNNB1 通路。而其具體機制還有待實驗進一步 探究。

綜上所述，lnc-MTBP-5在CRC 中表達增加，且其高表達與患者預后呈負相關；同時，lnc-MTBP-5可促進CRC 細胞的侵襲。因此，lnc-MTBP-5或可作為臨床評估CRC 發生與發展、遠處轉移的新型腫瘤標志物，其相關信號通路及分子機制亦將是我們下一步的研究重點。隨著研究的不斷深入，lnc-MTBP-5或可為臨床預防、治療CRC 及相關預后評估提供更加廣闊的前景。

參·考·文·獻

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