阿爾茨海默病引起的輕度認知功能損害的微小RNA 表達譜的生物信息學分析

何海寧，張 微，嚴 峰，史琰琛，王靜華，肖世富，王 濤

上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心老年精神科，上海交通大學阿爾茨海默病診治中心，上海 200030

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種常見的老年疾病，隨著我國老齡化進程的加速，由該病帶來的醫療護理和經濟負擔問題將日益嚴峻。AD 的主要病理特征為腦內β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積和神經纖維纏結（neurofibrillary tangle，NFT）[1]。然而近10 年來，針對上述病理機制開發的藥物Ⅲ期臨床試驗均紛紛宣告失敗，包括Aβ 單克隆抗體[2-3]、tau 蛋白拮抗劑[4]、β/γ-分泌酶抑制劑[5-6]等，這提示我們需要進一步研究AD 的病理機制以制定有效的干預策略。研究[7-9]顯示，AD 的認知衰退過程是一個疾病連續譜，AD 所致輕度認知功能損害（mild cognitive impairment，MCI）期（MCI due to AD）是AD 所致癡呆（dementia due to AD）的前驅期，也是早期干預的最佳切入點。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子單鏈非編碼RNA，可在轉錄后水平調控基因表達[10]。在神經元中特異表達的miRNA 是促進神經元生長發育、分化成熟和保持突觸功能的關鍵因子，對維持神經穩態發揮了重要作用[11-12]。既往研究[13-14]表明，AD 患者體內的某些特定miRNA 可通過調節相關基因[如淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、淀 粉 樣 前 體 蛋 白β 位 點 裂 解酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）等]參與AD 的病理過程，這可能是AD 的發病機制之一。目前，大部分研究都僅針對AD 患者，鮮少有針對AD 的前驅期——AD 所致MCI 患者的報道。而在疾病早期開展相關miRNA 的表達及其調控機制的研究，將有助于深入了解AD 的早期發病機制，亦可為其早期藥物的開發提供理論依據。

基于此，本研究通過對受試者的外周血血漿行miRNA 芯片測序，分析篩選出在AD 所致MCI 組血漿中顯著上調的miRNA，并對miRNA 的預測靶基因進行生物信息學分析，以探究miRNA 在AD 早期病理過程中的 作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象及其資料收集

本研究的納入對象篩選自中國縱向老齡化隊列研究（China Longitudinal Aging Study，CLAS）數據庫。CLAS的臨床研究注冊號為NCT03672448，該研究經上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心倫理委員會批準，并獲得了所有受試者和/或其法定監護人的書面知情同意。

本研究共納入10 例研究對象，其中AD 所致MCI 患者5 例（AD 所致MCI 組），認知功能正常老人5 名（對照組）。AD 所致MCI 組入組標準：①年齡60 ～90 歲。②符合2011 年美國國立衰老研究所和阿爾茨海默病協會（National Institute Aging and Alzheimer's Association，NIA-AA）修訂指南中“AD 所致MCI-中度可能”的診斷標準[9]。③18F-Flumetamol 正電子發射計算機斷層掃描（positron emission tomography，PET）檢測Aβ 陽性。排除標準：①軀體疾病、酒精、藥物或理化因素所致的認知功能損害。②存在重性精神疾病或嚴重軀體疾病。③存在嚴重視力、聽力障礙，不能配合完成認知功能評估。對照組入組標準：①年齡60 ～90 歲。②認知功能正常。排除標準：①存在重性精神疾病或嚴重軀體疾病。②存在嚴重視力、聽力障礙，不能配合完成認知功能評估。

收集所有受試者的人口學基本資料，包括性別、年齡和受教育年限，并采用蒙特利爾認知評估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）對患者的認知功能進行 評估。

1.2 樣本收集及RNA 提取

每位受試者空腹12 h 后，采集其靜脈血于EDTA 抗凝管中，4 ℃、1 207×g離心20 min 后，收集上層血漿。使用TRIzol 試劑（Invitrogen，美國）提取血漿RNA，具體操作步驟按照說明書進行。隨后，使用NanoDrop 1000（Thermo Fisher，美國）測定RNA 純度，吸光度比值 [D（260 nm） /D（280 nm）]在1.8 ～2.1 之間即為純度達標。

1.3 miRNA 芯片測序及分析

采用miRCURYLNATMmiRNA 芯片（Exiqon 公司，丹麥）探測受試者血漿樣本中miRNA 的表達情況，根據使用說明書進行操作。使用Axon GenePix 4000B 芯片掃描儀掃描芯片，GenePix Pro 6.0 讀取芯片掃描圖像，提取探針的信號值。相同的探針信號值取中值合并，保留所有樣本中均≥30.0 的探針值，對全部芯片進行中值標準化。使用獨立樣本t檢驗比較AD 所致MCI 組和對照組的組間差異。差異倍數（fold change，FC）的對數（log2FC） ≥ 1 被定義為上調，P＜0.05 為差異具有統計學意義，同時符合這2 個標準的miRNA 即為顯著上調miRNA。

本研究采用的芯片含有3 100 種探針，覆蓋所有在miRBase 19.0 數據庫中注釋的人、小鼠和大鼠的miRNA，同時也包括這些物種相關的病毒miRNA。此外，還有25個獨有的miRPlus 的人源miRNA 沒有被收錄在miRBase數據庫中。

1.4 miRNA 的靶基因預測

顯著上調miRNA 的靶基因采用TargetScan 7.2 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行預測，即通過搜索和miRNA 種子區域相匹配的保守8mer 和7mer 位點來預測其靶基因[15]，并根據cumulative weighted context++ scores 預測靶基因可信度，該分數值越低提示預測可信度 更高。

1.5 miRNA-基因相互作用網絡構建和關鍵miRNA 篩選

miRNA-基因相互作用網絡可使多個miRNA 與靶基因的相互作用可視化，尋找調控網絡中的關鍵miRNA 及關鍵基因。采用Cytoscape 軟件構建miRNA-基因相互作用網絡，分析miRNA 與靶基因之間的相互作用。靶基因的篩選閾值為cumulative weighted context++ score＜-0.6，刪去預測可信度低的靶基因，使最終的網絡能更直接地突出關鍵節點。采用CytoNCA 計算網絡中各節點的連接（degree，DC）值，刪去DC 值＜2 的基因節點，得到核心網絡；以cumulative weighted context++ scores 為加權值，計算DC 值，篩選核心網絡中的關鍵miRNA。

1.6 關鍵miRNA 靶基因的功能分析

基因本體數據庫（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路分析是描述基因生物學功能的常用方法[16]。使用R 語言分析包對核心網絡中關鍵miRNA 的靶基因進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，采用Benjamini-Hochberg 方法對多次比較的P值進行校正，以P＜0.01 篩選富集分析條目和通路信息。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對研究數據進行統計分析。符合正態分布的定量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行分析；定性資料以頻數和百分比表示，采用χ2檢驗分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 受試者人口學資料及臨床資料比較

結果（表1）顯示，2 組受試者在年齡、性別、受教育年限及MoCA 評分間差異均無統計學意義。

表1 2 組受試者人口學資料和臨床資料比較Tab 1 Comparison of demographic and clinical data between the two group

2.2 血漿miRNA 的表達情況

根據log2FC 和P值篩選顯著上調的miRNA，結果（表2）顯示，與對照組相比，AD 所致MCI 組的外周血血漿中存在13 個顯著上調的miRNA，且均為人源性（hsamiR）。顯著上調miRNA 的表達情況如圖1。

表2 AD 所致MCI 組患者的外周血血漿中顯著上調的miRNATab 2 Significantly up-regulated miRNAs in peripheral blood plasma of MCI due to AD group

圖1 AD 所致MCI 組患者的外周血血漿miRNA 的表達情況Fig 1 Expression of miRNAs in peripheral blood plasma of MCI due to AD group

2.3 miRNA-基因相互作用網絡及關鍵miRNA 篩選

miRNA-基因相互作用網絡如圖2A，其中hsa-miR-550a-3p、hsa-miR-424-3p 獨立于調控網絡，與其他miRNA無相互作用。移除DC 值＜2 的基因節點和2 個獨立的miRNA 節點后得到核心網絡，即包括11 個miRNA 和65 個基因節點（圖2B）。在核心網絡中計算以cumulative weighted context++ scores 加 權 的DC 值，排 在 前5 位 的miRNA 分別為hsa-miR-3202、hsa-miR-4443、hsa-miR-4747-5p、hsa-miR-4722-5p 和hsa-miR-5194。該5 個miRNA 被確定為調控網絡中的關鍵miRNA。DC 值＞2 的基因節點有CCHC 型鋅指核酸結合蛋白（CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein，CNBP）、泛素相關修飾物1（ubiquitin related modifier 1，URM1）、序列相似的83 家族 成 員F（family with sequence similarity 83 member F，FAM83F）、跨膜蛋白14（tetraspanin 14，TSPAN14）、視黃素（retbindin，RTBDN）、包含S1 的pleckstrin 同源結構域（pleckstrin homology domain containing S1，PLEKHS1）和argonaute RISC 催 化 組 分2（argonaute RISC catalytic component 2，AGO2），這7 個 關 鍵 基 因 被2 個 及 以 上miRNA 同時調控。

2.4 關鍵miRNA 的靶基因GO 富集分析

GO 富集分析結果（圖3）顯示，hsa-miR-3202 的靶基因主要涉及突觸可塑性的調節、Wnt 信號通路、甲基化依賴的基因沉默等生物學過程，hsa-miR-4722-5p 的靶基因主要涉及高爾基體小囊泡的轉運過程、多巴胺轉運、抗原的加工提呈等生物學過程，hsa-miR-4747-3p 的靶基因主要涉及神經遞質運輸、突觸間囊泡轉運、突觸間囊泡定位等生物學過程，hsa-miR-5194 的靶基因主要涉及miRNA 前體（pre-miRNA）的翻譯、谷氨酸受體信號通路、肌動蛋白纖維聚合、囊泡運輸等生物學過程，hsamiR-4443 的靶基因主要涉及I-κB 激酶/NF-κB 通路和調節淋巴細胞、單核細胞增殖等生物學過程。

2.5 關鍵miRNA 的靶基因KEGG 通路分析

KEGG 通路分析結果（圖4）顯示：hsa-miR-3202的靶基因主要參與Ras 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路和糖酵解/糖異生等通路，hsa-miR-4722-5p 的靶基因主要參與Ras 信號通路、細胞因子受體信號通路和胰島素信號通路等，hsa-miR-4747-3p 的靶基因主要參與MAPK 信號通路、糖酵解/糖異生、嘌呤代謝等通路，hsa-miR-5194的靶基因主要參與低氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、趨化因子信號通路和細胞內吞作用等通路，hsa-miR-4443 的靶基因主要參與Ras 信號通路、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、果糖/甘露糖代謝等 通路。

圖2 miRNA-基因相互作用網絡Fig 2 miRNA-target gene interaction network

圖3 關鍵miRNA 的靶基因GO 富集分析Figure 3 GO enrichment analyses of target genes of key miRNAs

圖 4 關鍵miRNA 的靶基因KEGG 通路分析Fig 4 KEGG pathway analyses of target genes of key miRNAs

3 討論

目前，AD 的生物標志物主要分為腦脊液相關蛋白標志物（Aβ42、Aβ40、總tau 蛋白和磷酸化tau 蛋白）和神經影像學檢測到的相關標志物（Aβ PET、結構磁共振成像顯示的腦萎縮）[17-18]。其中，腰椎穿刺獲取腦脊液樣本為有創操作，神經影像學檢查費用較為昂貴，無法大規模應用于臨床。然而目前，血液樣本的獲取相對簡便，且為無創或微創操作，較適用于AD 的早期篩查和診斷。本研究針對AD 所致MCI 患者的血漿miRNA 進行芯片測序及生物信息學分析，發現有13 個顯著上調的miRNA，其中5 個關鍵miRNA 參與了AD 的早期病理過程，或可作為早期診斷AD 所致MCI 的潛在生物標志物。同時，本研究納入的AD 所致MCI 患者均經18F-Fluementamol PET 金標準確診，提升了臨床診斷的可靠性[9]。但上述miRNA的血漿表達水平尚需進一步驗證，將其作為生物標志物用于診斷AD 所致MCI 的診斷效力仍需大樣本臨床研究加以證實。

本研究針對關鍵miRNA 的靶基因進行GO 富集分析發現，其主要參與突觸可塑性的調節、Wnt 信號通路、突觸間囊泡轉運、突觸間囊泡定位等生物學過程。突觸損傷是AD 疾病過程的早期事件，即在早期AD 患者和MCI 患者的大腦新皮層和海馬中均存在突觸連接喪失和突觸數量減少的情況[19-20]。海馬是記憶形成的關鍵腦區，海馬中的突觸損傷與認知能力下降密切相關。因此，我們推測hsamiR-3202 和hsa-miR-4747-3p 可能通過抑制突觸可塑性的調節、突觸間囊泡轉運和囊泡定位等生物學過程造成突觸損傷，進而引起AD 的發生。Wnt 信號通路主要參與細胞增殖、細胞凋亡、軸突導向、突觸形成和神經細胞再生等生物學過程[21-22]。近年來研究[23-24]發現，經典的Wnt/β-catenin信號通路廣泛參與神經元的增殖、分化、凋亡和突觸可塑性調節，在神經退行性疾病中發揮了重要作用。Tapia-Rojas等[25]研究發現，抑制Wnt 信號通路可以誘導海馬中Wnt 信號通路成分的改變和功能的喪失，從而引發tau 蛋白磷酸化和Aβ1-42 水平升高，造成APP 轉基因小鼠認知下降。因此，本研究結果提示hsa-miR-3202 可能通過抑制Wnt 信號通路，參與AD 早期的病理過程。另外，我們注意到hsamiR-5194 參與調節miRNA 前體的翻譯，提示hsa-miR-5194可能參與調控一些AD 相關miRNA 的表達。

KEGG 通路分析發現，關鍵miRNA 的靶基因主要參與Ras 信號通路、MAPK 信號通路、糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、果糖/甘露糖代謝等通路。研究[26-34]顯示，Ras 信號通路和MAPK 信號通路在AD 病理過程中起著重要作用。MAPK 是一組能被不同細胞外刺激激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要由細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）和p38-MAPK 共3 條信號轉導途徑組成。腦內MAPK/ERK 信號通路參與調節神經元的增殖和凋亡，且ERK 信號傳導可激活糖原合成激酶-3（glycogen synthesis kinase-3，GSK-3），造成APP和tau 蛋白磷酸化，與AD 的病理機制密切相關[26]。ERK的激活也可造成線粒體形態和功能異常，增強氧化應激反應[27]。而對AD 患者腦組織進行尸檢后發現，p38-MAPK在與學習和記憶相關的腦區中高度表達[28]，且其激活的發生是在疾病的早期[29-30]。p38-MAPK 的激活可導致細胞內鈣、活性氧產生，線粒體應激增加[31]。且體外研究[32]表明，p38-MAPK 可促進神經細胞凋亡。而Ras 蛋白可作為信號通路的分子開關，調控下游MAPK 信號通路；Ras/MAPK 級聯通路可參與海馬區CA1、杏仁核、齒狀回以及其他涉及學習和記憶的區域中突觸可塑性的調節[33]。同時，Ras 信號通路也可直接參與神經元生長發育過程，促進皮層神經元之間的突觸形成[34]。因此，針對本研究預測的上調miRNA 在體內的調控網絡和潛在的調控機制，我們推測該miRNA 可能通過調節這些相關的通路參與AD的發病過程。

總之，本研究首次提出了AD 所致MCI 患者的血漿中存在hsa-miR-3202 等13 種上調miRNA，其或可作為潛在的生物標志物用于對AD 所致MCI 的診斷研究；同時，本研究還發現，在miRNA-基因的調控網絡中存在5 個關鍵miRNA，其上調可能是AD 發生的重要因素。通過調控相關通路影響AD 的發生與發展，對AD 治療的藥物靶點研究和發病機制研究具有重要意義。

參·考·文·獻

[1] Ballard C, Gauthier S, Corbett A, et al. Alzheimer's disease[J]. Lancet, 377(9770): 1019-1031.

[2] Doody RS, Thomas RG, Farlow M, et al. Phase 3 trials of solanezumab for mild-to-moderate Alzheimer's disease[J]. N Engl J Med, 2014, 370(4): 311-321.

[3] Salloway S, Sperling R, Fox NC, et al. Two phase 3 trials of bapineuzumab in mild-to-moderate Alzheimer's disease[J]. N Engl J Med, 2014, 370(4): 322-333.

[4] Gauthier S, Feldman H, Schneider LS, et al. Efficacy and safety of tauaggregation inhibitor therapy in patients with mild or moderate Alzheimer's disease: a randomised, controlled, double-blind, parallel-arm, phase 3 trial[J]. Lancet, 2016, 388(10062): 2873-2884.

[5] Egan MF, Kost J, Voss T, et al. Randomized trial of verubecestat for prodromal Alzheimer's disease[J]. N Engl J Med, 2019, 380(15): 1408-1420.

[6] Henley D, Raghavan N, Sperling R, et al. Preliminary results of a trial of atabecestat in preclinical Alzheimer's disease[J]. N Engl J Med, 2019, 380(15): 1483-1485.

[7] Sperling RA, Aisen PS, Beckett LA, et al. Toward defining the preclinical stages of Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease[J]. Alzheimer's Dement, 2011, 7(3): 280-292.

[8] McKhann GM, Knopman DS, Chertkow H, et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease[J]. Alzheimers Dement, 2011, 7(3): 263-269.

[9] Albert MS, DeKosky ST, Dickson D, et al. The diagnosis of mild cognitive impairment due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease[J]. Alzheimers Dement, 2011, 7(3): 270-279.

[10] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2): 281-297.

[11] Schratt G. microRNAs at the synapse[J]. Nat Rev Neurosci, 2009, 10(12): 842-849.

[12] Fiore R, Siegel G, Schratt G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2008, 1779(8): 471-478.

[13] Tan L, Yu JT, Hu N, et al. Non-coding RNAs in Alzheimer's disease[J]. Mol Neurobiol, 2013, 47(1): 382-393.

[14] Silvestro S, Bramanti P, Mazzon E. Role of miRNAs in Alzheimer's disease and possible fields of application[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(16): E3979.

[15] Agarwal V, Bell GW, Nam JW, et al. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs[J]. Elife, 2015, 4: E05005.

[16] Ashburner M, Ball CA, Blake JA, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology[J]. Nat Genet, 2000, 25(1): 25-29.

[17] Olsson B, Lautner R, Andreasson U, et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet Neurol, 2016, 15(7): 673-684.

[18] Rabinovici GD, Gatsonis C, Apgar C, et al. Association of amyloid positron emission tomography with subsequent change in clinical management among medicare beneficiaries with mild cognitive impairment or dementia[J]. JAMA, 2019, 321(13): 1286-1294.

[19] Scheff SW, Price DA, Schmitt FA, et al. Hippocampal synaptic loss in early Alzheimer's disease and mild cognitive impairment[J]. Neurobiol Aging, 2006, 27(10): 1372-1384.

[20] Scheff SW, Price DA, Schmitt FA, et al. Synaptic alterations in CA1 in mild Alzheimer disease and mild cognitive impairment[J]. Neurology, 2007, 68(18): 1501-1508.

[21] Salinas PC. Wnt signaling in the vertebrate central nervous system: from axon guidance to synaptic function[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012, 4(2): A008003.

[22] Harrison-Uy SJ, Pleasure SJ. Wnt signaling and forebrain development[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012, 4(7): A008094.

[23] Fortress AM, Frick KM. Hippocampal Wnt signaling: memory regulation and hormone interactions[J]. Neuroscientist, 2016, 22(3): 278-294.

[24] Tiwari SK, Agarwal S, Seth B, et al. Curcumin-loaded nanoparticles potently induce adult neurogenesis and reverse cognitive deficits in Alzheimer's disease modelviacanonical Wnt/β-catenin pathway[J]. ACS Nano, 2014, 8(1): 76-103.

[25] Tapia-Rojas C, Inestrosa NC. Wnt signaling loss accelerates the appearance of neuropathological hallmarks of Alzheimer's disease in J20-APP transgenic and wild-type mice[J]. J Neurochem, 2018, 144(4): 443-465.

[26] Kirouac L, Rajic AJ, Cribbs DH, et al. Activation of Ras-ERK signaling and GSK-3 by amyloid precursor protein and amyloid β facilitates neurodegeneration in Alzheimer's disease[J]. eNeuro, 2017, 4(2). DOI: 10.1523/ENEURO. 0149-16.2017.

[27] Gan XQ, Huang SB, Wu L, et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease cybrid cell[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1842(2): 220-231.

[28] Yasuda S, Sugiura H, Tanaka H, et al. P38 MAP kinase inhibitors as potential therapeutic drugs for neural diseases[J]. Cent Nerv Syst Agents Med Chem, 2011, 11(1): 45-59.

[29] Sun AY, Liu M, Nguyen XV, et al. P38 MAP kinase is activated at early stages in Alzheimer's disease brain[J]. Exp Neurol, 2003, 183(2): 394-405.

[30] Pei JJ, Braak E, Braak H, et al. Localization of active forms of C-Jun kinase (JNK) and p38 kinase in Alzheimer's disease brains at different stages of neurofibrillary degeneration[J]. J Alzheimers Dis, 2001, 3(1): 41-48.

[31] Calkins MJ, Reddy PH. Amyloid β impairs mitochondrial anterograde transport and degenerates synapses in Alzheimer's disease neurons[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1812(4): 507-513.

[32] Chen B, Teng Y, Zhang XG, et al. Metformin alleviated Aβ-induced apoptosisviathe suppression of JNK MAPK signaling pathway in cultured hippocampal neurons[J]. Biomed Res Int, 2016, 2016: 1421430.

[33] Selcher JC, Weeber EJ, Christian J, et al. A role for ERK MAP kinase in physiologic temporal integration in hippocampal area CA1[J]. Learn Mem, 2003, 10(1): 26-39.

[34] Kim IJ, Drahushuk KM, Kim WY, et al. Extracellular signal-regulated kinases regulate dendritic growth in rat sympathetic neurons[J]. J Neurosci, 2004, 24(13): 3304-3312.