促性腺激素釋放激素拮抗劑上調小鼠種植窗期子宮自然殺傷 細胞比例并增強其毒性

周文潔，徐步芳

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院生殖醫學中心/婦產科，上海 200025

近年來，在體外受精-胚胎移植（in vitrofertilization and enlbryo transfer，IVF-ET）技術的控制性促排卵方案中，促性腺激素釋放激素拮抗劑（gonadotropin-releasing hormone-antagonist，GnRH-ant）方案的使用呈逐年上升趨勢。大量臨床研究[1]證明，與傳統黃體期長方案相比，GnRH-ant 方案不僅可以減少促性腺激素使用天數及總用量，降低囊腫及卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）等嚴重并發癥的發生率，還具有較低的周期取消率。然而亦有多項研究[2-4]發現，該方案的胚胎植入率、臨床妊娠率均低于長方案，從而限制了其在臨床上的廣泛應用。同時，既往針對GnRHant 方案的研究[5-6]顯示，該方案所獲胚胎質量并未降低，而其中所使用的GnRH-ant 導致子宮內膜容受性低下是影響胚胎著床的主要原因。我們前期研究[7]發現，在GnRHant 組與自然周期組患者取卵后第7 日（著床期）的子宮內膜芯片差異表達基因中，有部分基因與自然殺傷細胞（natural killer cell，NK cell，NK 細胞）介導的細胞毒性途徑相關；同時，還發現GnRH-ant 組子宮自然殺傷細胞（uterine NK cell，uNK cell，uNK 細胞）的數量增加，其毒性分子穿孔素（perforin，Pf）的表達亦增加，繼而提示GnRH-ant 可能通過介導uNK 細胞的免疫功能影響子宮內膜容受性，進而導致胚胎著床率下降。迄今，臨床上尚無改善由GnRH-ant 方案所致的子宮內膜容受性低下狀態的有效藥物。基于前期研究，我們進一步利用GnRH-ant 方案小鼠模型深入分析GnRH-ant 對于母-胎界面免疫及子宮內膜容受性的調控作用機制，以期為探尋提高拮抗劑方案內膜容受性的藥物治療效果提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

7 ～8 周齡雌性健康未孕C57BL/6 小鼠16 只[購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動物生產許可證：SCXK（滬）2014-0002]，體質量20 ～30 g。該實驗小鼠飼養于上海交通大學醫學院實驗動物科學部SPF 級動物房的標準籠中，動物使用許可證：SYXK（滬）2018-0027。于12 h 晝夜節律、25 ℃恒溫恒濕條件下，小鼠自由飲水、飲食。所有實驗動物相關操作均獲得上海交通大學醫學院實驗動物使用和管理委員會批準。

注射用醋酸西曲瑞克（GnRH-ant，Merck，德國），人絕經期尿促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG，麗珠醫藥集團股份有限公司），人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG，麗珠醫藥集團股份有限公司）。胞內染色試劑盒（BioLegend，美國），Annexin Ⅴ染色試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodexyuirdine，BrdU，Sigma，美國），Ⅳ型膠原酶（Sigma，美國）。搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），低溫離心機（Eppendorf，德國），流式細胞儀（BD，美國）。流式細胞實驗中所用抗體，具體信息見表1。

表1 流式細胞實驗所用抗體Tab 1 Antibodies for flow cytometry

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及小鼠模型建立 連續觀察2 個動情周期均正常后，將16 只小鼠隨機分為對照組和GnRH-ant 組，每組8 只。行小鼠陰道分泌物涂片確定其動情周期，經亞甲藍染色后，顯微鏡下觀察為動情周期第3 日開始，每日向GnRH-ant 組小鼠腹腔注射GnRH-ant（1.5 μg/100 g，連續7 d）；對照組小鼠則于相同時間點注射等體積生理鹽水[8]。第7 日，2 組小鼠需再注射HMG（40 U/100 g）；次日，注射HCG（100 U/100 g）48 h 后為小鼠子宮種植窗期，即造模成功。于此時用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剖腹取出子宮以備后用。

1.2.2 小鼠子宮原代細胞分離 使用眼科剪將收集的小鼠子宮組織剪碎至約1 mm3碎塊，經Ⅳ型膠原酶消化后加入含5%胎牛血清培養液終止消化。后經300 目篩網過濾，1 000×g離心5 min 獲得細胞沉淀，并利用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，待用。

1.2.3 小鼠uNK 細胞比例及其胞內毒性因子檢測 將上述分離的子宮原代細胞用流式染色緩沖液稀釋為1×106個/mL 的細胞懸液。向每個檢測管中加入100 μL 細胞懸液，再分別向其中加入2 μg/mL 的抗CD45、抗CD3 和抗NK1. 1 的單克隆抗體進行uNK 細胞表面染色，用以標記uNK細胞，并于4 ℃避光孵育30 min；采用染色緩沖液洗滌2次，加入固定破膜劑，4 ℃固定、打孔30 min；采用透膜緩沖液洗滌2 次，加入抗Pf 和抗Gz-B 抗體，4 ℃避光孵育30 min；而后，再次用染色緩沖液洗滌2 次，于流式細胞儀上機檢測。

1.2.4 uNK 細胞增殖檢測 于小鼠處死前3 日，每日向每只小鼠腹腔注射BrdU 1 mg，連續注射3 d。頸椎脫臼處死小鼠后，分離子宮原代細胞，配置為100 μL 細胞懸液，并進行uNK 細胞表面染色，經固定、破膜（方法同前）后，加入熒光素標記的抗BrdU 單克隆抗體，并于4 ℃避光孵育30 min，最終于流式細胞儀上進行檢測。

1.2.5 uNK 細胞凋亡檢測 uNK 細胞表面染色方法同1.2.3 中所述。隨后，采用細胞凋亡檢測試劑盒對uNK 細胞的凋亡進行檢測，具體操作參照說明書進行，最終于流式細胞儀上進行分析。

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行作圖，采用SPSS 21.0 軟件對研究數據進行統計分析。采用雙尾Student'st檢驗進行比較，且實驗均重復3 次及以上。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠uNK 細胞比例和增殖水平檢測

以CD45、CD3 和NK1.1 標記小鼠uNK 細胞后，采用流式細胞術對2 組小鼠的uNK 細胞進行分析；結果（圖1A、B）顯示，與對照組相比，GnRH-ant 組小鼠uNK 細胞比例升高（P=0.000）。采用BrdU 體內摻入法檢測GnRH-ant 對uNK 細胞增殖的影響，結果（圖1C、D）顯示，與對照組相比，GnRH-ant 組小鼠uNK 細胞的增殖水平上調（P=0.000）。

圖1 流式細胞術檢測2 組小鼠uNK 細胞比例和增殖水平Fig 1 Detection of the proportion and proliferation of mouse uNK cells in the two groups by flow cytometry

2.2 小鼠uNK 細胞凋亡檢測

以CD45、CD3 和NK1.1 標記小鼠uNK 細胞后，采用熒光標記的磷脂結合蛋白 Annexin Ⅴ染色，并用流式細胞術檢測GnRH-ant 對uNK 細胞凋亡的影響。結果（圖2） 顯示，與對照組相比，GnRH-ant 組小鼠uNK 細胞凋亡水平下降（P=0.004）。

2.3 小鼠Pf 及Gz-B 的表達水平檢測

Pf 和Gz-B 是NK 細胞發揮毒性作用的主要細胞因子，本研究對小鼠uNK 細胞內的這2 個因子的表達水平進行分析，結果（圖3）顯示，與對照組相比，GnRH-ant組小鼠uNK 細胞內Pf（P=0.000）和Gz-B（P=0.034）的表達水平均較高。

圖2 流式細胞術檢測2 組小鼠uNK 細胞凋亡Fig 2 Detection of the apoptosis of mouse uNK cells in the two groups by flow cytometry

圖3 流式細胞術檢測2 組小鼠uNK 細胞中Pf 及Gz-B 的表達水平Fig 3 Detection of the expression levels of Pf and Gz-B of mouse uNK cells in the two groups by flow cytometry

3 討論

近年來，GnRH-ant 方案憑借其簡便、靈活、安全、有效等優勢在輔助生殖領域得到了廣泛應用，但GnRH-ant對內膜容受性的不利影響使得該方案的胚胎種植率及臨床妊娠率偏低[2-6]。Macklon 等[9]研究發現，與自然周期方案組相比，GnRH-ant 方案組子宮內膜中多種與細胞黏附、信號轉導及T 細胞受體信號通路相關的基因表達發生了顯著變化。另外，Ruan 等[10]研究發現，注射GnRH-ant 的小鼠種植窗期子宮內膜白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和整合素β3（integrin β3）的表達均有下調，繼而推測GnRH-ant 方案可能通過作用免疫細胞功能影響子宮內膜容受性，但其相關機制尚需進一步探索。

我們通過臨床研究[11]證實，針對卵巢儲備功能正常的患者，靈活降低拮抗劑方案中GnRH-ant 的用量可增加臨床妊娠率；從而提示，GnRH-ant 對于子宮內膜容受性的不利影響與劑量相關。另外，我們的前期研究[7]還發現，相比于長方案組及自然周期組，GnRH-ant 組患者在著床期的uNK 細胞數量有所增加，Pf 表達上調，且其兩者均與GnRH-ant 劑量呈正相關；繼而表明，GnRH-ant可增加子宮內膜uNK 細胞的數量并發揮毒性作用。uNK細胞是母-胎界面免疫細胞中占比最高的淋巴細胞，在正常妊娠過程中該細胞毒性較低，可通過表面受體識別滋養細胞，分泌干擾素（interferon，IFN）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、LIF 等有利于滋養細胞的侵襲、血管重塑，在調節子宮內膜容受性及維持正常妊娠中發揮重要作用[12-13]。在正常月經周期和妊娠期間，uNK 細胞在免疫細胞中的比例將發生變化，即月經周期中分泌期uNK 細胞的比例較增生期顯著增加，妊娠期間早孕期蛻膜NK 細胞比例也隨孕周的增加明顯上升。除比例改變外，uNK 細胞還可通過細胞毒性分子如Pf、Gz-B等介導的顆粒胞吐途徑發揮細胞毒性作用[12-13]。當母體出現異常炎癥反應或免疫增強時，可激活uNK 細胞發生細胞毒性作用，繼而誘發胚胎著床失敗、流產甚至早產、子癇前期等病理妊娠結局[12-13]。相關研究[14]已證實，部分不孕癥和復發性自然流產患者的uNK 細胞數量明顯 較高。

本研究結果表明，與對照組相比，GnRH-ant 組小鼠著床期uNK 細胞增殖水平提升，凋亡水平下降，導致該細胞比例明顯高于對照組，同時該組小鼠uNK 細胞內Pf及Gz-B 的表達水平也明顯升高，繼而提示GnRH-ant 組小鼠uNK 細胞毒力較強。該結果與接受拮抗劑方案促排患者的子宮內膜表現相符，從而說明接受拮抗劑促排小鼠或可作為研究GnRH-ant 影響母-胎界面免疫功能及子宮內膜容受性的較好模型。未來，我們將在此小鼠模型的基礎上，進一步深入分析GnRH-ant 影響uNK 細胞比例及毒性的調控機制。例如既往研究[15]報道GnRH-ant 可抑制患者內膜同源盒基因A10（HOXA-10）表達；HOXA-10可作為子宮內膜容受性的標志性分子及重要功能分子，對uNK細胞功能分化具有一定的調控作用[7,12,15]；另有研究[16]發現敲除HOXA-10能通過促進T 細胞增殖誘導免疫失衡等。同時，我們還將在后續研究中借助動物模型進一步闡明GnRH-ant 通過下調HOXA-10等途徑影響子宮免疫細胞包括uNK 細胞的比例及毒性作用的相關機制，并在此基礎上進一步探索改善IVF 拮抗劑方案患者子宮內膜容受性的臨床藥物治療靶點。

參·考·文·獻

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