醬油渣中免疫活性肽水解用酶的篩選

于志成 劉步青 許 宙 陳茂龍 焦 葉崔 波 鄒飛雪 藏慶佳 程云輝,

(長沙理工大學化學與食品工程學院1,長沙 410114)(齊魯工業大學(山東省科學院)食品科學與工程學院；生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室2, 濟南 250353)(煙臺雙塔食品股份有限公司3,煙臺 265404)

醬油發酵后經壓榨或抽油產生的剩余殘渣即為醬油渣[1]。據中國調味品協會統計，2017 年我國醬油生產總量已達860萬 t[2]，按照每生產1 t醬油產生0.67 t醬油渣計算[3]，醬油渣年產量可達580萬 t。醬油渣中含有粗蛋白、碳水化合物和粗脂肪等營養成分[4,5]，不失為一種廉價的生物資源，特別是其中的大豆分離蛋白營養價值高、氨基酸含量豐富，被譽為“植物肉”[6]。目前醬油渣再利用的主要途徑是生產飼料[7]，但存在含鹽量較高、適口性較差及不易貯存等缺點[8]，在一定程度上限制了醬油渣的應用價值。利用合適的水解酶從醬油渣蛋白中制備免疫活性肽，可使醬油渣資源得到更高值化利用[9]。

免疫活性肽是指對機體免疫系統具有調節作用的一類生物活性肽，其免疫調節作用包括免疫促進和免疫抑制[10,11]。免疫活性肽雖本身不具有免疫原性，但能通過被腸道吸收或在腸道與受體結合而發揮免疫作用[12]。近年來，人們對食源性蛋白中免疫活性肽的研究日益增多，食物蛋白來源包括牛奶、魚類、貝類、大米、大豆等[13]。國內外制備活性肽的方法主要有酶解法[14]、化學合成法[15]、基因重組法[16]及微生物發酵[17]等，其中使用商業蛋白酶進行體外水解是最常用的方法，肽鍵的裂解能夠釋放具有免疫調節活性的肽段。由于酶的不同切割特異性，選擇合適的蛋白水解酶成為關鍵技術因素。評價蛋白水解產物免疫調節作用的常用研究方法包括細胞實驗和動物喂養實驗[13]。由于巨噬細胞是體液免疫的重要防線，所以巨噬細胞增殖能力的強弱與體液免疫能力有著重要關系[18]，采用MTT法檢測巨噬細胞活性已被較廣泛運用于評價生物活性肽的免疫調節作用。同時，由一氧化氮合酶催化L-精氨酸產生的NO，能作為一種重要的細胞分泌物在炎癥和休克等生理過程中擔任信號分子的作用，通常可用NO的釋放量來衡量巨噬細胞中的炎癥作用[19]。

因此，本研究以小鼠巨噬細胞增殖實驗的SI值和脂多糖炎癥模型細胞內NO釋放量作為免疫活性肽的篩選指標，擬利用Acalase、Papain、Pepsin、Trypsin與Protamex 5種蛋白酶對醬油渣蛋白進行酶解，進而對5種酶解物的免疫活性、多肽含量、可溶性氮回收率和相對分子質量進行分析，篩選出最佳的醬油渣免疫活性肽水解用酶，為醬油渣資源高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油渣、小鼠巨噬細胞(RAW264.7)、石油醚、Folin酚、L-酪氨酸；Acalase、Papain、Pepsin、Trypsin及Protamex；D201-C大孔吸附樹脂。

1.2 儀器與設備

FE28 pH計，JJ-T電動攪拌器，TDL-5-A離心機，SHZ-D循環水式真空泵，EV 311旋轉蒸發器，FD-1真空冷凍干燥機，HH CP-01二氧化碳細胞培養箱，MLS-3750滅菌鍋，SW-OJ-1FD超凈工作臺， 96孔培養板；血球計數板，DNM-9602酶標分析儀。

1.3 方法

1.3.1 醬油渣蛋白粉的制備方法[20]

1 kg脫脂醬渣粉溶于10 L蒸餾水中，用2 mol/L氫氧化鈉調溶液pH至10→攪拌2 h→離心(3 500r/min,30 min)→取上清→用2 mol/L鹽酸滴定至pH 4.0→離心(3 500 r/min,10 min)→水洗3次(3 500 r/min,10 min)→取沉淀→冷凍干燥。

1.3.2 醬油渣蛋白酶解物制備方法[20]

5種蛋白酶的酶解條件見表1。5%醬渣蛋白懸浮液→50 ℃恒溫溶解30 min→調至各酶最適溫度→調至各酶最適pH→加酶酶解3 h(6 000 U/g)→滅酶(15 min，90 ℃)→離心取上清→真空濃縮→大孔吸附樹脂脫鹽→冷凍干燥。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

1.4 分析方法

1.4.1 基本成分分析方法

水分含量的測定參考GB/T 5009.3—2016中的直接干燥法；蛋白含量的測定參考GB/T 5009.5—2010中的凱氏定氮法；脂肪含量的測定參考GB/T 5009.6—2016中的索氏提取法；總糖含量的測定用苯酚硫酸法[21]；鹽分的測定參考GB 5009.44—2016中的電位滴定法。

1.4.2 蛋白酶活力的測定方法

參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》。

1.4.3 多肽含量的測定方法

參考GB/T 22492—2008《大豆肽粉》[22]。

1.4.4 相對分子量測定方法

相對分子量采用液相色譜[23]法測定：

1)色譜條件：色譜柱為TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm。流動相使用水/乙腈/三氟乙酸，90/10/0.1；經0.45 μm濾膜過濾后再經超聲進行脫氣。洗脫流速0.5 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫30 ℃，上樣量10 μL。

2)樣品的制備：用流動相將樣品配成濃度為1 mg/mL的樣液，超聲混勻，用微孔濾膜過濾后待測。

3)分子量校正曲線所用標準品：甘氨酸-酪氨酸(MW239.2)；纈氨酸-酪氨酸-纈氨酸(MW379.5)；蛋氨酸腦啡肽(MW573.23)；亮氨酸腦啡肽(MW555.63-569.65)；血管緊張素Ⅱ(MW1 269)；細胞色素C(MW12 900)。

1.4.5 小鼠巨噬細胞增殖實驗方法

MTT法測定小鼠巨噬細胞的增殖活性。用移液槍取對數期的小鼠巨噬細胞，細胞濃度7×105個/mL、每孔100 μL接種于96孔板中，在5% CO2的培養箱中37 ℃恒溫孵育4 h后，以6復孔為一組，每孔加入醬油渣蛋白酶解物20 μL(6.25 μg/mL)，空白對照組加無菌水20 μL，繼續在培養箱中恒溫孵育20 h；在終止孵育前4 h加入20 μL MTT(5 mg/L)；棄去每孔中的液體，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜，避光條件下搖床中輕振10 min[24]，490 nm下酶標儀測吸光度(OD值)，SI值計算公式：

1.4.6 酶解物對脂多糖炎癥模型細胞內NO釋放的影響

當培養皿中的小鼠巨噬細胞生長至對數期時，棄掉細胞培養基上清，用移液槍吸取2 mL培養基將細胞輕輕吹下，12 000轉離心收集細胞，96孔培養板中接種3×104個/孔的細胞，每孔200 μL細胞液，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，以6復孔為一組，分為陰性對照組、LPS炎癥模型組、陽性對照組和醬油渣蛋白酶解物預處理組[25]：

1) 陰性對照組：加入含10% FBS的DMEM培養基；

2) 炎癥模型組：加入含10% FBS的DMEM培養基，培養12 h，再加入用DMEM培養基稀釋的LPS溶液20 μL，培養24 h；

3) 陽性對照組：加入含10% FBS的DMEM培養基，培養12 h，再加入用無菌水稀釋的IgG 20 μL，培養24 h；

4) 樣品預處理組：加入無菌水溶解的樣品溶液，使樣品的終濃度為6.25 μg/mL，培養12 h，加入用DΜEM培養基稀釋的LPS溶液，培養24 h。

收集細胞培養基上清，于4 ℃、12 000 轉低溫離心5 min以去除細胞雜質等。根據GRIESS法測定上清液中NO含量。NO抑制率公式：

NO抑制率=

1.5 可溶性氮回收率的測定方法

采用福林酚法測定上清液蛋白質含量[26]：使用0.05 mol/L (pH8.0) NaHPO4-NaH2PO4緩沖液將上清液稀釋一定倍數至測定范圍，取2.5 mL稀釋樣品于10 mL玻璃試管，加入2.5 mL堿性銅試劑，振蕩混勻，室溫放置10 min，再加入0.25 mLFolin-酚試劑，立即振蕩混勻，室溫放置30 min后于500 nm下測定吸光度。配制0～0.5 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)標準曲線，計算上清液蛋白質含量。

上清液蛋白質量(g)=上清液蛋白含量×上清液體積

醬油渣蛋白質量(g)=醬油渣蛋白含量×醬油渣質量

醬油渣蛋白可溶性氮回收率=

1.6 數據處理

實驗均設置3次平行，結果用平均值±標準偏差表示。實驗數據采用excel進行分析，每組間差異用Student’s t-test平均值的成對二樣本進行分析，P<0.01表示有極顯著性差異，P<0.05表示有顯著性差異，P>0.05表示沒有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 醬油渣和醬油渣蛋白基本成分分析

對醬油渣原料干基及所提取的醬油渣蛋白的主要成分進行測定，結果見表2。脫脂后提取的醬油渣蛋白脂肪質量分數降為1.23%；鹽分和水分質量分數分別降為0.91%和2.42%；而總糖質量分數從10.31%提高至37.52%，張興茂[20]通過Sevag試劑法來驗證糖蛋白，推測醬油渣蛋白中含有大量的糖蛋白，據此可認為醬油渣蛋白中總糖含量的提高與提取過程中糖蛋白的富集有關。

表2 原料醬油渣(干基)及醬油渣蛋白的主要化學成分

2.2 不同蛋白酶酶解物可溶性氮回收率的比較

2.2.1 蛋白酶選擇及酶活測定

目前蛋白酶主要來源于動物、植物和微生物，Pepsin和Trypsin是動物來源的蛋白酶，Pepsin的酶切位點是Phe和Leu等疏水性氨基酸，Trypsin的酶切位點為賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等堿性氨基酸[27]；Papain是一種植物來源的蛋白酶，其酶切位點是Arg、Lys、Phe，其中Arg和Lys是堿性氨基酸，而Phe是疏水性氨基酸[27]；Protamex和Acalase是微生物來源的蛋白酶，復合蛋白酶兼具內、外切酶的活性，能較徹底地酶解蛋白質，Acalase的酶切位點是Ala、Leu、Val等疏水性氨基酸，酶切位點廣泛，水解效果好[28]。本研究擬在同等酶活下考察5種酶的酶解產物在免疫活性、分子量分布及可溶性氮回收率方面的差異，因此參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》測定了所選定5種蛋白酶的酶活，結果如表4所示。由表3可知，Acalase酶活最高，可達276 229.6 U/g。

表3 實驗所用5種蛋白酶的酶活

2.2.2 不同蛋白酶酶解物可溶性氮回收率的分析

注：*與對照組相比，P<0.05；**與對照組相比，P<0.01。圖1 5種蛋白酶酶解物可溶性氮回收率的比較

本研究比較了5 種醬油渣蛋白酶酶解物的可溶性氮回收率，結果如圖1所示。5種蛋白酶酶解物中Protamex酶解物可溶性氮回收率最低，與Protamex酶解物(對照組)可溶性氮回收率相比，Papain酶解物差異不顯著，Pepsin酶解物差異顯著(P<0.05)，Acalase和Trypsin酶解物差異極顯著(P<0.01)，且Acalase酶解物可溶性氮回收率最高為89.43%。在工業化生產中，提高酶解物的可溶性氮回收率，具有降低生產成本、提高原料利用效率等優點。

2.3 醬油渣蛋白不同蛋白酶酶解物的多肽含量分析

對醬油渣蛋白不同蛋白酶酶解物的多肽含量進行測定，結果見表4。5種蛋白酶酶解物中多肽含量最高的是堿性蛋白酶酶解物，占比51.47%；而在可溶性氮回收率的測定結果中堿性蛋白酶酶解物的可溶性氮回收率也最高，二者結果一致。

表4 5種蛋白酶酶解物的多肽含量

2.4 不同蛋白酶酶解物的性質研究

2.4.1 不同蛋白酶酶解物免疫活性研究

分別以小鼠巨噬細胞RAW264.7 MTT增殖實驗SI值和脂多糖(LPS)炎癥模型細胞內NO釋放量作為考察指標，考察了不同蛋白酶酶解物的免疫活性，結果如圖2和圖3所示。

注：*與對照相比，P<0.05；**與對照相比，P<0.01。圖2 5種蛋白酶解物對RAW264.7細胞增殖活性的影響

由圖2可知，除Acalase酶解物外，其他4種蛋白酶酶解物在濃度6.25 μg/mL時對小鼠巨噬細胞RAW264.7皆具有顯著增殖作用(P<0.05)，但Trypsin和Protamex酶解物增殖作用高于陽性對照IgG，Pepsin和Papain酶解物增殖作用低于陽性對照IgG。Acalase酶解物在6.25 μg/mL時對RAW264.7細胞的增殖作用存在極顯著差異(P<0.01)，其SI值最高為1.09且比陽性對照IgG的增殖效果好。

注：##：與陰性對照組比有極顯著差異P<0.01；*：與炎癥模型組比有顯著差異P<0.05；**：與炎癥模型組比有極顯著差異P<0.01。圖3 5種蛋白酶解物對LPS內誘導RAW264.7細胞內NO釋放量的影響

由圖3可知，在6.25 μg/mL的濃度下，不同酶解物對NO的抑制效果有顯著差異，這可能跟其酶切位點及特異性不同相關。與炎癥模型組相比，Pepsin酶解物、Trypsin酶解物和Protamex酶解物對細胞內NO釋放量都存在一定抑制作用，但抑制率相對較低；Papain酶解物對細胞內NO釋放量存在顯著(P<0.05)抑制作用，抑制率為7.81%；Acalase酶解物對細胞內NO釋放量存在極顯著(P<0.01)抑制作用，抑制率為10.80%，Acalase酶解物對細胞內NO釋放量的抑制作用最強。

MTT增殖實驗和脂多糖(LPS)炎癥模型實驗表明堿性蛋白酶酶解物對RAW264.7細胞增殖效果及細胞內NO釋放抑制作用皆為最強。這可能跟Acalase 的酶切位點有關，有研究表明，多肽的免疫活性可能與其所含疏水性氨基酸的比例相關[29]。Acalase的酶切位點為Ala、Leu、Val，采用該酶水解食源性蛋白可能獲得更多富含疏水性氨基酸的酶解物。Lee等[30]采用堿性蛋白酶酶解短頸蛤蛋白，得到的肽序列Gln-Cys-Gln-Gln-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Val能在LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞中顯示出NO抑制活性，其中含有疏水性氨基酸。He等[31]從波紋巴非蛤肉蛋白堿性蛋白酶解物中得到的免疫活性肽Pro-His-Thr-Cys，Val-Gly-Try-Thr，Glu-Phe，Leu-Phe等能夠顯著增強小鼠淋巴細胞增殖能力，其中疏水性氨基酸比例較高。

2.4.2 不同蛋白酶酶解物分子量分布的分析

采用液相色譜對不同蛋白酶酶解物的分子量分布進行測定，結果如表5所示。5種蛋白酶酶解物的分子量分布范圍主要在2 000 u以下，免疫活性較好的Acalase和Papain酶解物中2 000 u以下的組分分別占98.21%、97.74%，其中分子量在180 u以下的比例分別為5.92%和6.13%，因此可推斷酶解物中游離氨基酸的含量較低；分子量分布在3 000 u以上的比例分別僅為0.11%和0.12%，說明酶解物中的大分子量肽段很少。肽的免疫活性與其分子量大小密切相關，大量研究結果表明小分子量肽段的免疫活性較好[13]。據此可推測5種蛋白酶酶解物中分子量范圍為180～1 000 u的肽段可能具有較強的免疫活性。Acalase酶解物和Papain酶解物中180～1 000 u的肽段比例較高，分別為81.33%和78.03%，這可能也是兩種酶解物具有較強免疫活性的原因之一。

表5 5種蛋白酶酶解物的分子量分布

3 結論

通過考察5種醬油渣蛋白酶酶解物對小鼠巨噬細胞增殖指數SI值、脂多糖(LPS)炎癥模型中細胞內NO釋放量的抑制作用、相對分子量分布、多肽含量及可溶性氮回收率，本研究認為Acalase是制備醬油渣免疫活性肽的最佳水解酶，其SI值、NO釋放量抑制率、分子量180～1 000 u的組分占比、多肽含量及可溶性氮回收率分別為1.09、10.80%、81.33%、51.47% 和89.43%。其酶解物不僅免疫活性較好，而且多肽含量和可溶性氮回收率較高，工業推廣方面應用前景廣闊。