四重實時熒光PCR快速檢測轉基因玉米及其加工產品

王鳳軍 葉素丹 凌 云 周曉紅

(浙江經貿職業技術學院，杭州 310012)

《2017年全球生物技術/轉基因作物商業化發展態勢》報告顯示全球轉基因作物商業化種植面積達到了1.898億公頃，創歷史新高，從1996年到2017年，全球轉基因農作物商業化22年間，種植面積增長了約112倍。自1992年以來全球67個國家/地區的監管機構批準了來自先正達、孟山都、巴斯夫和柯迪華等跨國農業生物技術公司的4 133項監管審批，涉及26個轉基因作物的476個轉基因轉化體。其中，1 995項食用，1 338項飼用，800項用于種植或環境釋放[1]。從全球轉基因作物種植品種來看，主要以大豆、玉米、棉花、油菜四大作物為主，其中轉基因玉米2017年種植面積為3 384萬公頃，占全球轉基因種植面積的45.1%，是種植面積第二大的作物。目前全球轉基因玉米共146個品系，主要有耐除草劑、抗蟲、改善品質、耐旱及抗蟲+耐除草劑、品質和耐除草劑等轉基因性狀[2]。

2018年，美國、阿根廷、澳大利亞、巴西、加拿大等13個國家簽署了關于推進精準生物技術在農業領域應用的聯合聲明，就基因編輯農作物采取一致和可靠的措施。我國已批準的轉基因生產應用安全證書并在有效期內的作物有棉花、水稻、玉米和番木瓜，但進行商業化種植的轉基因作物僅有棉花和番木瓜。中國批準進口用作加工原料的轉基因作物大豆、玉米、油菜、棉花和甜菜等均需獲得我國的安全證書。我國制定的《農業轉基因生物進口安全管理辦法》《農業轉基因生物加工審批辦法》等，規定轉基因生物標識的監督管理及標識檢查驗證[3,4]。

轉基因作物給人們帶來了優良的性狀，解決了糧食短缺問題，但也存在潛在的安全性，如生態系統破壞、自然資源庫污染、新型病原體產生和外來物種的侵入以及人類健康危險等[5-7]。因此有必要對轉基因產品的進行外源基因檢測，控制未批準的轉基因產品的流通。為提高檢測準確性和時效性，主要以實時熒光PCR和數字PCR為主[8-15]。Michaela H?hne等[16]應用實時熒光PCR對轉基因玉米Bt11、Bt176、 Mon810和T25 品系中的35S-CaMV外源基因進行檢測。梁文等[17]使用數字PCR技術對轉基因玉米MON89034、MON810、MIR162中的品系特異性基因片段和內源基因進行定量分析。

本研究通過多重引物和熒光探針組合篩選，反應體系優化，特異性、重復性和靈敏性測試以及樣品適用性檢測等過程開發建立了四重熒光定量PCR檢測技術。該技術的使用可實現一個反應管中同時檢測兩個靶標基因，降低試劑成本，縮短檢測時間，提高檢測效率，為玉米及其深加工產品轉基因成分的快速檢測提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

10% MON810、10%Bt11、100% MON863、Bt176、GA21轉基因玉米標準品；CNAS T025-24/30、CNAS T0659-23/74/79/104/175、ACAS-T067-J273/J213，FAPAS GeMSU 56A/56B均為中國合格評定國家認可委員會(CNAS)/英國食品與環境研究院(FAPAS)能力驗證樣品；松仁玉米、甜糯玉米、玉米酥和爆米花等26種玉米及其深加工制品均為市售。

1.2 試劑

植物DNA提取試劑盒(69104)、 SureFood PREP Plant X(S1006)、TransStart Probe qPCR SuperMix(AQ401-02)，探針與引物委托機構合成。

1.3 方法

1.3.1 核酸樣本制備

稱取玉米粉、玉米片、玉米糝等干重樣品40 mg或玉米汁、玉米餅和玉米米酒等濕重樣品150 mg，按照基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作，非粉末樣品使用液氮研磨或勻漿器進行破碎30 s，其中洗脫液使用滅菌雙純水50 μL。玉米深加工制品采用試劑盒進行操作。樣品提取后使用RNA酶對RNA進行降解，再使用NanoDrop-one核酸蛋白分析儀測試DNA的含量和純度。

1.3.2 引物和探針設計

采用國際農業生物技術應用服務組織(ISAAA)轉基因批準數據庫檢索轉基因玉米批準商業化種植品系及轉化事件，分析各類轉化事件被轉入的外源基因，選定花椰菜花葉病毒35S啟動子(pCaMV35S)、農桿菌的胭脂堿合成酶基因終止子(tNOS)以及根癌農桿菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)為外源基因，選定編碼玉米淀粉合成酶異構體zSTSII-2 (zSSIIb) 基因作為玉米物種的內參照基因。使用Primer 5.0軟件和Peimer-BLAST設計多重引物和熒光探針。熒光探針報告基團按照設備性能以及波長范圍，設置NED、VIC、FAM和Cy5為報告基團，采用非熒光淬滅基團進行熒光信號收集，其中VIC和NED采用MGB分子信標熒光探針。

1.3.3 單重熒光PCR反應

反應體系為20 μL，在200 μL光學PCR反應管中依次加入：Nuclease-free蒸餾水1.2 μL，TransStart Probe qPCR SuperMix (2×) 10 μL，Passsive Reference Dye II(50×) 0.4 μL，引物(10 μmol/L)0.4 μL、探針(10 μmol/L)0.2 μL和擴增模板1 μL。反應參數設置為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s共兩步法，其中第二步設置40個循環。在ABI QuantStudio Q5實時熒光PCR儀進行擴增反應。每個基因設置3個平行實驗，每次檢測設置以轉基因玉米標準品DNA為模板的陽性對照，以已知非轉基因玉米樣品為陰性對照，以及提取空白對照和PCR反應空白對照。

1.3.4 多重熒光PCR反應

反應體系為20 μL, 在多重熒光定量PCR反應體系加入4組檢測引物和探針，TransStart Probe qPCR SuperMix，Passsive Reference Dye II和基因組DNA等成分(具體見表1)，熒光定量PCR反應參數同1.3.3。使用QuantStudioTMDesign & Analysis software進行數據分析和處理。

表1 四重熒光定量PCR的反應混合液組成

1.3.5 引物探針特異性檢測

提取ACAS-T067-J273轉基因玉米樣本以及非轉基因玉米粉樣本基因組DNA，使用1.3.3單重實時熒光PCR體系進行擴增，確定樣品中目標外源基因，確保基因組DNA提取的有效性。按照1.3.4四重熒光定量PCR體系進行多重檢測，驗證4個基因之間在多重熒光反應體系中的熒光信號是否有干擾。

1.3.6 靈敏性檢測

提取ACAS-T067-J273轉基因玉米樣本基因組DNA，按照10倍濃度稀釋5個梯度，稀釋介質為Nuclease-free dd H2O。根據玉米的單倍體基因組分子質量約為2.6 pg。稀釋后標準品每個反應分別為13 000、1 300、130、13、1.3拷貝。以5個梯度的標準品分別為模版，進行四重實時熒光定量反應，每個濃度設置3個重復，驗證方法的靈敏性和檢測范圍。以拷貝數的自然對數值為橫坐標，以Ct值為縱坐標繪制內源基因zSSIIb和外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS的標準曲線，求得線性方程，相關系數和擴增效率。

1.3.7 適用性檢測

對農貿市場、超市等流通的玉米產品及其深加工制品以及實驗室收集的各種轉基因玉米標準品，能力驗證樣品以及轉基因大豆、棉花、番茄等轉基因陽性樣品進行四重實時熒光PCR反應，篩查檢測是否含有pCaMV35S、tNOS和EPSPS外源基因。

2 結果與分析

2.1 核酸樣本制備結果

用核酸蛋白分析儀測定基因組DNA的質量和濃度，所有材料的基因組DNA OD260/OD280的比值大多為1.6～2.0，經測試其濃度為50～250 ng/μL，符合熒光PCR擴增要求，統一稀釋成100 ng/μL，-20 ℃保存備用。

2.2 引物和探針特異性檢測

按照1.3.2中的方法針對轉基因玉米內參照基因zSSIIb和外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS引物和多重熒光探針，序列見表2。

表2 轉基因玉米特異性檢測的引物和探針序列

2.3 特異性檢測結果

提取轉基因玉米ACAS-T067-J273和非轉基因玉米ZY1711樣本基因組DNA，使用上述多重熒光定量PCR體系進行轉基因成分檢測，驗證方法的特異性。圖1為轉基因玉米ACAS-T067-J273和非轉基因玉米ZY1711多重反應的結果，內源基因zSSIIb均產生了明顯的S型擴增曲線，Ct值小于35。外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS在轉基因玉米中檢出，且擴增曲線呈現明顯的S型，而非轉基因玉米中不檢出，空白對照無信號，檢測基因之間無信號干擾，外源基因的反應結果與期望結果一致，表明引物探針的設計及反應體系的設置具有特異性，可用于玉米轉基因成分的篩查檢測。

圖1 外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS以及內源基因zSSIIb四重熒光PCR反應的擴增曲線圖

2.4 重復性和靈敏性檢測

轉基因玉米ACAS-T067-J273梯度稀釋后DNA四重實時熒光PCR擴增的Ct值見表3所示，四個基因相關系數R2為0.992～0.996。同一基因同一稀釋梯度范圍內Ct值的變異系數較小，重復性較好。zSSIIb基因Ct值變化范圍在19.26～34.39之間，標準偏差在0.048～0.837，R2為0.993，擴增效率為96.1%；外源基因pCaMV35S的Ct值變化范圍在22.70～37.68，標準偏差在0.082～0.605，R2為0.992，

表3 轉基因玉米多重熒光定量PCR靈敏性檢測Ct值分析表

擴增效率為104%；外源基因tNOS的Ct值變化范圍在24.01～37.83，標準偏差在0.160～0.876，R2為0.996，擴增效率為97.2%，外源基因EPSPS的Ct值變化范圍22.84～37.45，標準偏差在0.054～0.704，R2為0.996，擴增效率為91.4%，表明該四重實時熒光PCR擴增體系穩定性較高，重復性較好，最低檢測限為每20 μL反應1.3個拷貝，最低定量限為每20 μL反應13個拷貝。

2.5 樣品檢測結果

對購自農貿市場的松仁玉米、甜糯玉米、玉米酥和爆米花等26種玉米及其深加工制品等樣品以及轉基因玉米標準品和能力驗證樣品進行四重實時熒光PCR檢測，同時按照SN/T 1204—2016《植物及其加工產品中轉基因成分 實時熒光PCR定性檢測方法》中所述的引物和探針、檢測步驟和反應程序對樣品進行檢測[18]，結果見表4。經SN/T 1204—2016標準反應體系驗收和盲樣測試的10個轉基因標準品和能力驗證樣品四重實時熒光PCR反應均為陽性，26個市場抽樣的玉米制品分別經四重實時熒光PCR檢測和標準方法檢測，均為陰性。表明本實驗研究開發的四重實時熒光PCR反應體系適用于玉米轉基因成分的篩查檢測，尤其是大量樣本的快速檢測。

表4 四重熒光定量PCR反應對轉基因玉米、大豆標準品和CNAS/FAPAS能力驗證樣品的篩查檢測結果

續表4

3 討論

目前我國已批準的轉基因生產應用安全證書并在有效期內的轉基因玉米品系共21種，主要轉入了抗蟲、抗除草劑，改良α-淀粉酶、甘露糖代謝等外源基因，見表5。通過數據庫中各轉基因玉米產品中轉入的外源基因信息，以及國內外已報道的轉基因農產品抗蟲、抗病、抗除草劑和耐儲等相關基因的序列以及轉基因啟動子/終止子序列，選擇3～4個常用的外源基因和內源基因作為靶標基因。對靶標基因特定序列設計引物和熒光探針，用不同報告基團(不同顏色的熒光信號)標記，通過發射波長篩選最佳的報告集團的組合，合成后用于多重熒光定量PCR，根據其擴增曲線、標準曲線和擴增效率，篩選出最適合的3～4對引物和探針用于多重熒光定量分析。

為降低多重反應中目標基因間的熒光信號干擾，通過十字交叉法和棋盤法優化熒光PCR反應參數(包括體系中Mg2+、引物、探針和模板濃度)，建立多重實時熒光定量PCR檢測技術。使用陽性對照樣品或陽性質粒作為標準品建立標準曲線，進行準確性和靈敏性的實驗比對分析，確定多重熒光定量PCR體系中各基因的線性檢測范圍，分析檢測靈敏度和重復性，進行多重熒光定量PCR反應體系的方法學驗證。

表5 國內已批準的轉基因生產應用安全證書并在有效期內的的轉基因玉米品系及相關信息

各品牌的熒光定量PCR儀的通道和提供的檢測光譜范圍的差異，決定了在選擇探針的發光基團和淬滅基團時要根據所用儀器型號設進行設置。本研究使用QuantStudio Q5實時熒光PCR儀，含有FAM/SYBR GreenI，VIC/HEX/CY3，ROX/Texas Red，Cy5，TAMARA等5色熒光檢測通道，可實現同一個反應孔中同時對多個外源基因進行檢測，節省試劑耗材成本，操作簡易，尤其適合多樣品的檢測分析。

4 結論

本實驗基于四重熒光PCR 技術，通過多重引物和探針篩選，反應條件優化，方法學驗證等，建立了可同時對pCaMV35S、tNOS和EPSPS三 個外源基因和 zSSIIb 玉米內參照基因進行檢測的體系。檢測體系通過各類標準品和市場抽樣樣本進行適應性驗證，檢測結果與SN/T 1204—2016標準檢測結果一致，檢測方法具有較好的準確性和可靠性，適用于農作物種子品系溯源、食品原料玉米成分轉基因元件檢測，對玉米及其深加工制品產品市場的轉基因成分標識制度的完善，規范轉基因產品的市場監管，確保食品安全有重要意義。