兩步法催化魚油制備MLM型結構三酰甘油酯

鐘 晨 何勇錦,2 Zheng Guo 陳必鏈,2

(福建師范大學生命科學學院1，福州 350117)(福建師范大學;工業微生物教育部工程研究中心2，福州 350117)(Department of Engineerin, Aarhus University3，Aarhus 8000 Denmark)

結構三酰甘油酯是一類特殊的油脂，即通過化學方法或酶催化方法將目的脂肪酸嵌入到甘油骨架的特定位置。已有大量臨床實驗表明，食用結構三酰甘油酯可提高機體免疫力、抑制血栓形成、預防肥胖等[1-3]。目前，科技工作者已將短鏈(C2～C6)、中鏈(C8～C12)和長鏈(≥C14)脂肪酸嵌入到甘油結構的特定位置上，旨在制備具有特殊理化性質的結構三酰甘油酯。其中，中鏈脂肪酸位于甘油結構的sn-1與sn-3位置上和長鏈飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸位于sn-2位置上的結構三酰甘油酯(MLM型結構三酰甘油酯)，已受到消費者的青睞[4]。食用這類結構酯，經機體胰酶水解后，腸道細胞所吸收中鏈脂肪酸運輸到肝臟進行β-氧化代謝提供能量；2-單酰甘油酯的脂肪酸經乳糜作用重新形成三酰甘油和/或合成磷脂，進一步組裝吸收構成細胞膜和/或生物膜的結構[4]。因此，開發MLM型結構三酰甘油酯是改性油脂的熱門方向之一。

與化學法相比，采用脂肪酶催化制備MLM型結構三酰甘油酯，具有如下優點：反應條件溫和、酶具有底物特異性、避免催化底物的氧化。當前，脂肪酶催化制備MLM型結構三酰甘油酯的方法有一步酶催化法和兩步酶催化法[5，6]。一步酶催化法是指利用sn-1,3選擇性的脂肪酶催化三酰甘油酯和中鏈脂肪酸或其乙酯，使甘油骨架上的sn-1,3脂肪酸被替換成中鏈脂肪酸，最終生成MLM結構三酰甘油酯[7]。由于該方法制備的MLM結構三酰甘油酯純度不高和嵌合率低(<50%)，影響該方法的推廣。為了解決這個問題，研究者開發了兩步酶催化法，即先通過sn-1,3選擇性的脂肪酶醇解反應生成2-單酰甘油酯，再利用脂肪酶催化2-單酰甘油酯與中鏈脂肪酸發生酯化反應形成MLM結構三酰甘油酯。

魚油是消費者攝取多不飽和脂肪酸的主要來源[8]。食用多不飽和脂肪酸(如亞油酸(LA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))可以治療和/或預防癌癥、中風、痛風、炎癥等疾病，降低機體血液的膽固醇和血脂濃度，提高機體免疫力，促進腦細胞、神經細胞等組織和器官的生長和發育等。因此，利用魚油為底物開發結構三酰甘油酯具有重要意義。Robles課題組[9]選擇Novozym 435作為催化劑，通過兩步酶催化法催化鱈魚肝油制備MLM結構型三酰甘油酯。Irimescu等[10]首先利用Novozym 435醇解催化鰹魚魚油獲得2-單酰甘油酯，隨后再利用Lipozyme RM IM催化2-單酰甘油酯與辛酸(CA)乙酯制備MLM結構三酰甘油酯。與Novozym 435和Lipozyme RM IM相比，Lipozyme TL IM是一種價格更低廉的sn-1,3選擇性脂肪酶[11-13]。基于此，利用Lipozyme TL IM作為生物催化劑開發MLM結構型三酰甘油酯，可以大大降低工藝成本。但是，關于Lipozyme TL IM催化魚油制備MLM結構三酰甘油酯的報道甚少。因此，本研究選擇Lipozyme TL IM作為生物催化劑，通過兩步酶催化法(醇解反應和酯化反應)催化魚油制備MLM結構型三酰甘油酯(M=CA)。研究工藝參數(如含水量、催化溫度等條件)對Lipozyme TL IM催化性能的影響。同時，利用核磁共振儀、氣相色譜儀和差示掃描熱量法(Differential scanning calorimetry，DSC)分析產物的脂肪酸組成及其位置分布、結晶點和熔點，為MLM結構型三酰甘油酯的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鳀魚魚油、固定化Lipozyme TL IM。

1.2 主要儀器與設備

ZNCL-BS智能磁力攪拌器,MK-6s薄層色譜-火焰離子化檢測器,SCION 436-GC氣相色譜儀,Pyris 6差示掃描量熱儀。

1.3 方法

1.3.1 優化Lipozyme TL IM兩步酶催化法制備MLM結構三酰甘油酯的工藝條件

第一步醇解催化反應：在室溫條件下，醇解催化體系組成為0.5 g鳀魚魚油、無水乙醇、蒸餾水和10%固定化酶Lipozyme TLIM(基于魚油質量)組成的。研究水含量和乙醇與底物的摩爾比對Lipozyme TL IM催化魚油生成2-單酰甘油產量的影響，獲得制備2-單酰甘油的優化條件。為了獲得足夠的2-單酰甘油酯，通過小型攪拌式反應器進行放大實驗，制備2-單酰甘油酯。

第二步酯化催化反應：利用Lipozyme TL IM催化2-單酰甘油酯與辛酸(C8∶0)制備CA-L-CA結構三酰甘油酯，以0.1 g的2-單酰甘油酯為底物，研究溫度、單酰甘油酯與辛酸的摩爾比和催化時間對結構三酰甘油酯產量的影響，獲得催化制備MLM結構三酰甘油酯的最適工藝條件。

1.3.2 Lipozyme TL IM的可再利用性

為了降低工藝成本，Lipozyme TL IM的可再生利用性進行評估。在最優條件下，通過離心(5 000r/min，5min)收集反應后(醇解反應和酯化反應)的酶試劑。用無水乙醇：正己烷(1∶1)洗滌酶試劑三次，隨后置于抽真空裝置中處理24 h，去除有機溶劑。將收集的Lipozyme TL IM再次進行兩步酶催化反應，以2-單酰甘油酯和MLM結構三酰甘油酯產量為指標，評估Lipozyme TL IM的可再利用次數。

1.4 參數測定

利用Luddy等[14]和Wang等[15]的方法，測得鳀魚魚油的sn-2位置脂肪酸組成。利用薄層色譜法-火焰離子檢測器(TLC-FID)分析技術[16]，對含脂肪酸乙酯(FAEEs)，三酰甘油酯(TAGs)，游離脂肪酸(FFA)，二酰甘油酯(DAGs)和單酰甘油酯(MAGs)的樣品進行定量定性分析。油脂樣品通過甲酯化后，通過氣相色譜儀(Trace GC Ultra，Thermo Scitific)測定脂肪酸的組成，使用SLB-IL-111色譜柱(Supelco，直徑為0.25 mm，厚度為0.2 μm)測定各脂肪酸[17]。采用核磁共振儀(Bruker Advance 400MHZ)分析鳀魚魚油和產物的油脂類型和脂肪酸組成[18,19]。利用Pyris 6 DSC儀器(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, USA)分析原油、2-單酰甘油酯和MLM結構三酰甘油酯的結晶點和熔點[20]。利用差示掃描量熱儀(Pyris 6 DSC)分析測得油脂樣品的熔點和結晶點。

基于實驗室的方法[17]，收集2-單酰甘油酯。酯化反應后，100 mg樣品置于硅膠柱(直徑10 mm，長度100 mm，硅膠粉顆粒大小，200～300目)上，用40 mL的正己烷∶乙醚(9∶1)溶劑洗脫柱子，收集MLM結構型三酰甘油酯。MLM結構三酰甘油酯的轉化率可用如下公式進行計算:

MLM結構型三酰甘油酯的轉化率(wt%)= MLM結構型三酰甘油酯的質量×100%/(2-單酰甘油酯質量+辛酸質量)

2 結果與討論

2.1 魚油的脂肪酸特性

從圖1a可看出，鳀魚魚油的碳譜在69.52和69.31處有信號。已有研究表明，三酰甘油酯的甘油骨架碳譜信號分布于69.4左右[21]。這個結果可說明，鳀魚魚油底物是以三酰甘油酯形式存在的。采用氣相色譜儀測得脂肪酸組成，結果見表1。鳀魚魚油的主要脂肪酸是棕櫚酸(PA，17.8%)、油酸(OA，23.14%)、亞油酸(LA，8.24%)、EPA(8.08%)、DHA(9.76%)；魚油的長鏈飽和脂肪酸(LSFAs)和多不飽和脂肪酸(PUFA)的質量分數分別為23.76%和36.31%。值得注意的是，DHA主要分布在魚油的sn-2位上，其質量分數為20.88%。同時，采用13C-NMR技術分析魚油脂肪酸位置分布情況，結果見圖1b。DHA也主要分布在甘油骨架的sn-2位上。通過積分DHA峰值后，sn-2-DHA與sn-1(3)-DHA的摩爾比為2.15∶1，這個結果能氣相色譜儀測定的結果sn-2-DHA和sn-1(3)-DHA的摩爾比為(20.88%÷311)：[(9.76%×3)÷311]≈2.48∶1吻合。在sn-2位上，鳀魚魚油的總飽和脂肪酸(SFAs)和PUFAs含量分別為23.76%和50.06%。因此，利用鳀魚魚油制備CA-SFAs-CA和CA-PUFAs-CA兩種結構三酰甘油酯，有利于嬰幼兒[22]和成年人[23]對營養元素的吸收。為了制備純度高的CA-SFAs+PUFAs-CA結構三酰甘油酯，有必要評估和優化Lipozyme TL IM的兩步酶催化的工藝條件。

表1 鳀魚魚油及其sn-2位和Lipozyme TL IM醇解反應制備2-單酰甘油酯的脂肪酸組成

注：MFAs為單不飽和脂肪酸，SDA為十八碳四烯酸。圖1 鳀魚魚油的碳譜信號

2.2 優化 Lipozyme TL IM催化魚油制備2-單酰甘油酯的工藝條件

研究含水量(0、1%、5%、9%和13%)對Lipozyme TL IM催化魚油生成2-單酰甘油酯產量的影響，結果見圖2a。當含水量為5%或9%，Lipozyme TL IM催化魚油生成的2-單酰甘油酯含量高于其他組的結果。因此，Lipozyme TL IM催化三酰甘油制備2-單酰甘油酯最適含水量為5%～9%。

圖2 不同因素對Lipozyme TL IM催化魚油生成2-單酰甘油酯產量的影響

在含水量為5%條件下，進一步研究不同乙醇與魚油的摩爾比對Lipozyme TL IM催化魚油生成2-單酰甘油酯產量的影響，結果見圖2b。乙醇與底物的摩爾比從2∶1增加32∶1時，Lipozyme TL IM催化魚油生成的2-單酰甘油酯產量逐漸增加(從1.43%上升到32.49%)。當乙醇與底物的摩爾比繼續增加到64∶1時，Lipozyme TL IM催化底物生成的2-單酰甘油酯產量，無顯著差異。因此，為了降低工藝成本，選擇32∶1為Lipozyme TL IM催化油脂生成2-單酰甘油酯的最適合乙醇與油脂的最佳摩爾比。

2.3 小規模放大制備2-單酰甘油酯

為了降低酶試劑的使用量，在進行小規模放大實驗時，選擇5%的Lipzoyme TL IM酶載量，制備2-單酰甘油酯。由圖3a可得，隨著反應時間的延長(0～12 h)，底物三酰甘油酯含量逐漸下降，二酰甘油酯的含量先上升后下降的趨勢，2-單酰甘油酯(35%左右)和脂肪酸乙酯(60%左右)質量分數先上升后趨于恒定值。當反應進行至8 h時，醇解反應體系中的各油脂類型的含量基本處于平衡狀態，2-單酰甘油酯質量分數維持在35%左右。

在反應結束后，通過TLC板分離獲得2-單酰甘油酯，利用GC-FID測定2-單酰甘油酯的脂肪酸組成，結果見表1。Lipozyme TL IM催化魚油生成的2-單酰甘油酯的脂肪酸組成與原油的sn-2的脂肪酸組成(表1)無顯著差異。同時，2-單酰甘油酯的脂肪酸組成能與13C-NMR測定結果(圖3c)相一致。此外，圖3b是通過13C-NMR技術分析2-單酰甘油酯的碳譜結果。由圖3b可得Lipozyme TL IM催化魚油所得的2-單酰甘油酯質量分數超過90%，即11.08×100%÷(11.08+1)≈91.72%。這些結果可進一步表明，Lipozyme TL IM是一種sn-1,3選擇性的脂肪酶，在醇解反應過程中，該酶主要作用甘油骨架的sn-1和3位上的脂肪酸，從而形成2-單酰甘油酯產物。

注：醇解反應條件：30 g魚油、醇油比為32∶1，Lipozyme TL IM酶載量為5%，反應溫度為25 ℃。圖3 小規模放大制備2-單酰甘油酯

2.4 優化Lipozyme TL IM催化2-單酰甘油酯與辛酸制備MLM結構三酰甘油酯的工藝參數

從表2結果可知，催化溫度會影響Lipozme TL IM催化制備MLM結構三酰甘油酯產量。當溫度為40 ℃時，Lipozyme TL IM催化制備MLM結構型三酰甘油酯的質量分數最高，達89.81%。根據Arrhenius定律，提高反應溫度有利于產物的生成[24]。但當催化溫度高于40 ℃時，Lipozyme TL IM催化制備結構三酰甘油酯質量分數低于90%。這結果不符合Arrhenius定律，可能是因為酶生物催化劑與化學催化劑的組成成分是不一樣。過高的溫度抑制酶的活性，從而影響酶的催化速率和結構三酰甘油酯產量。

表2 不同條件對Lipozyme TL IM催化2-單酰甘油酯與辛酸生成MLM結構型三酰甘油酯產量的影響

底物的摩爾比和催化時間也有影響Lipozyme TL IM催化制備MLM結構三酰甘油酯產量。當2-單酰甘油酯與辛酸的摩爾比從1∶2增加到1∶3時，MLM結構三酰甘油酯產量從77.06%提高到89.81%。當2-單酰甘油酯與辛酸的摩爾比繼續提高到1∶4時，MLM結構三酰甘油酯產量為91.84%，與底物摩爾比為1∶3的結果相似。同時，當催化時間從12 h(實驗號7)增加到24 h，MLM結構三酰甘油酯含量也隨之增加(51.32%提高到89.81%)；當催化時間再延長至36 h時，MLM結構三酰甘油酯的含量已不再增加(88.28%)。因此，由表2可得，Lipozyme TL IM催化2-單酰甘油酯與辛酸制備MLM結構三酰甘油酯含量的最適催化條件為：以正己烷作為有機溶劑介質，催化溫度為40 ℃，2-單酰甘油酯與辛酸的摩爾比為1∶3，催化時間為24 h。

表3 MLM結構三酰甘油酯及其sn-2位的脂肪酸組成/%

MLM結構型三酰甘油酯及其sn-2位的脂肪酸組成，結果見表3。MLM結構三酰甘油酯的CA、SFAs、EPA、DHA和PUFAs質量分數分別為62.47%、72.93%、3.02%、7.55%和16.52%。對于MLM結構三酰甘油酯的sn-2位脂肪酸組成，SFAs、EPA、DHA、n-3PUFAs和PUFAs質量分數分別為29.79%、9.09%、20.37%、35.22%和44.67%。基于表3結果可得，MLM結構三酰甘油酯的主要類型是CA-LSFAs-CA和CA-PUFAs-CA。在sn-2上，CA質量分數為7.52%；這個結果表明，在酯化反應過程中，Lipozyme TL IM有發生酰基轉移的現象。以前的研究也發現，脂肪酶催化過程中會發生酰基轉移的現象[25]。

在最優條件下，評估Lipozyme TL IM的可再利用性，降低工藝成本。通過評估發現，Lipozyme TL IM進行醇解反應和酯化反應制備MLM結構三酰甘油酯只能再利用3次。在進行第4次時，2-單酰甘油酯和MLM結構三酰甘油酯質量分數顯著下降到20.58%和75.48%。為了解決這個問題，今后的研究可開發更穩定的固定化載體，提高Lipozyme TL IM的可再利用次數。

本研究中，經優化后，Lipozyme TL IM催化鳀魚魚油制備2-單酰甘油酯和MLM結構三酰甘油酯的質量分數分別約為35%和92%。這兩個值接近于Roxana等[7]所報道的結果。但是，Roxana等選擇較昂貴的Novozym 534(醇解反應，30.8%2-單酰甘油酯)和Lipzoyme RM IM(酯化反應，85.3%MLM結構三酰甘油酯)進行兩步法制備MLM結構三酰甘油酯，大大增加了工藝成本[22]。因此，選擇更低廉的Lipozyme TL IM作為催化劑，開發MLM結構三酰甘油酯具有更廣闊的應用前景。

2.5 魚油、2-單酰甘油酯和MLM結構三酰甘油酯的結晶點和熔點

從圖4可看出，鳀魚魚油的結晶溫度范圍分別約為-31.17～-5.17 ℃和-33.50～-5.60 ℃。魚油的熔點溫度范圍約為-31.58～21.00 ℃，含有3個熔點峰，即-17.80、4.25、12.25 ℃。圖4表明，Lipozyme TL IM催化魚油分別生成的2-單酰甘油酯的熔點和結晶點曲線也有所差異。在圖4a中，2-單酰甘油酯的結晶溫度范圍約為4.5～21.67 ℃，含有一個峰，即10.67 ℃。MLM結構三酰甘油酯的結晶溫度范圍分別為-18.50～38.50 ℃(2個響應峰，-25.17、-18.52 ℃)和-16.17～-36.33 ℃(2個響應峰，-22.14、-18.00 ℃)。這說明，改性魚油后制備MLM結構三酰甘油酯的結晶溫度略低于魚油原油的結晶溫度，也顯著低于它們為底物催化生成2-單酰甘油酯的結晶溫度。這是因為Lipozyme TL IM改性魚油后，魚油的sn-1,3的長鏈脂肪酸被替換成辛酸(脂肪酸碳鏈變短)，從而使MLM結構三酰甘油酯的結晶溫度降低。此外，2-單酰甘油酯的結晶溫度顯著高于三酰甘油(原油和結構三酰甘油酯)的結晶溫度。Cheong等[26]研究豬油單酰甘油酯、二酰甘油酯和三酰甘油酯的結晶和熔點變化，也報道過該結果，其原因是單酰甘油酯和三酰甘油酯的結構不同。因此，通過圖4的結果，可為不同功能性油脂包括2-單酰甘油酯和MLM結構三酰甘油酯的具體應用范圍提供實踐依據。

圖4 魚油、2-單酰甘油酯和MLM結構型三酰甘油酯的結晶點和熔點

3 結論

本研究建立了一種以Lipozyme TL IM作為生物催化劑催化鳀魚魚油制備MLM結構三酰甘油酯的兩步酶催化法。在醇解反應中，Lipozyme TL IM催化魚油制備單酰甘油酯質量分數約為35%，其中2-單酰甘油酯質量分數占91.72%。在2-單酰甘油酯與辛酸的酯化反應中，Lipozyme TL IM制備MLM結構三酰甘油酯的最大轉化率91.84%。MLM結構三酰甘油酯的主要類型是CA-SFAs-CA和CA-PUFAs-CA。基于這些結果可表明，Lipozyme TL IM催化魚油開發嬰幼兒CA-SFAs-CA產品和成年人CA-PUFAs-CA產品等高值化產品，為脂肪酶的應用提供參考。