甘薯渣多糖提取、分離純化及抗氧化活性研究

陳樹俊 崔 云

(山西大學生命科學學院，太原 030006)

甘薯是我國主要糧食作物之一，含有豐富的營養物質[1]，常用于生產甘薯淀粉類等產品，其產生的副產物甘薯渣難以處理，除極少部分用作飼料外，大部分被丟棄。但甘薯渣中含有許多未利用的可溶性膳食纖維類等多糖類物質[2]。多糖是一種生物活性物質，因為具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、提高免疫力[5]等功效被廣受關注。劉捷等[6]研究了水浴醇沉法提取紅薯葉多糖，并測定其為β-吡喃糖化合物。但對甘薯渣多糖的研究鮮有報道。本實驗用超聲輔助提取甘薯渣多糖，對比得使用Sevag-酶法脫蛋白[7]，H2O2法脫色[8，9]，透析，DEAE-52纖維素分級[10]得SPRP-1，用SephadexG-100和紫外吸收光譜法[11]對SPRP-1純度鑒定，并研究其抗氧化活性[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯(4月份)產自山西太原、牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶(80萬u/g)、DEAE-52纖維素、SephadexG-100、DPPH等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SP-2000UV型紫外分光光度計，SC-3614低速離心機，HHS-21-4電熱恒溫水浴鍋，SHZ-Ⅲ旋轉蒸發儀，MS-H-S標準加熱型磁力攪拌器，SB-5200DTD超聲波清洗機，SCIENTZ-18N真空冷凍干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 提取

1.3.1.1 超聲輔助提取

將新鮮甘薯洗凈，打漿機2次破碎，3層紗布過濾2次得鮮甘薯渣，60 ℃條件下烘干10 h，粉碎過60目篩得甘薯渣樣品。稱1 g樣品，適當條件超聲輔助熱水浸提后，4 000 r/min離心15 min，濃縮，加95%乙醇4 ℃醇沉過夜，4 000 r/min離心15 min，冷凍干燥得粗多糖。

1.3.1.2 多糖含量測定

參考馬風偉等[13]方法，標準品為葡萄糖，以吸光度(y)和葡萄糖濃度(x)得標準曲線y=9.931 4x-0.051 6R2=0.999 1，測定多糖得率。

式中：m1為多糖質量/mg；m為樣品質量/mg。

1.3.1.3 單因素實驗

料液比：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；超聲溫度：30、40、50、60、70 ℃；超聲功率：160、180、200、220、240 W；超聲時間：40、50、60、70、80 min。每組實驗重復3次，得各單因素對多糖得率影響。

1.3.1.4 響應面實驗設計

以料液比，超聲溫度，超聲功率，超聲時間(x)，甘薯渣多糖得率(y)，根據Box-Behnken實驗設計原理，結合單因素結果，采用四因素三水平響應面進行實驗，優化超聲波輔助提取甘薯渣多糖工藝，實驗因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

1.3.2 脫蛋白

1.3.2.1 蛋白質含量測定

參考楊玉芳[14]方法，標準品為牛血清白蛋白，以吸光度(y)和牛血清白蛋白濃度(x)得標準曲線y=0.004 6x+0.073 8，R2=0.999 3，測定蛋白質含量。

1.3.2.2 方法

Sevag法：取適量多糖溶液，加1/3體積(氯仿∶正丁醇=4∶1)氯仿-正丁醇溶液攪拌1 h，8 000 r/min離心20 min得上清液。重述操作直至無沉淀產生。

TCA法：取適量多糖溶液，加適量30%三氯乙酸溶液，4 ℃靜置過夜，8 000 r/min離心20 min得上清液。

酶法：取適量多糖溶液，加2%木瓜蛋白酶，調pH 6.0，50 ℃水浴2 h，8 000 r/min離心20 min得上清液。

Sevag-酶法：在酶法基礎上用Sevag法脫蛋白得上清液。

Sevag-TCA法：在TCA法基礎上用Sevag法脫蛋白得上清液。

比較上述方法，計算蛋白質清除率及多糖損失率。

1.3.3 脫色

H2O2法：用1 mol/LNaOH溶液調溶液pH 8.5，加1/3體積30% H2O2溶液，50 ℃下脫色2 h，直至顏色不再改變，冷卻后調pH 7.0。

活性炭法：將活性炭洗凈過濾，120 ℃烘干10 h，冷卻備用。取20 mL多糖溶液，加1.5%活性炭，60 ℃脫色2 h。

反膠束法：取4 mg/mL多糖溶液100 mL，沸水浴30 min，3 000 r/min離心3 min，取上清液40 mL加0.467gNaCl攪拌溶解，放置備用。取1 mL反膠束溶液和3 mL多糖處理液，混勻3 min后靜置30 min，檢測下層溶液。

比較上述方法，計算脫色率及多糖損失率。

1.3.4 透析

脫蛋白、脫色后多糖溶液還存在一些如無機鹽等小分子雜質需要除去，將多糖溶液置于透析袋中，放入蒸餾水中透析72 h，每24 h換1次水，換3次。

1.3.5 分級

將多糖溶液濃縮上樣到處理好的DEAE-52纖維素柱上，用蒸餾水、0.1～1 mol/LNaCl的Tris-HCl溶液依次洗脫，流速為1 mL/min，每6 min收集一管，用苯酚-硫酸法在波長490 nm處測定洗脫液吸光度，以吸光度(y)、管號(x)繪制洗脫曲線。洗脫液濃縮，冷凍干燥得精多糖。

1.3.6 純度鑒定

SephadexG-100凝膠柱層析：配制6 mg/mL多糖溶液上樣到處理好的SephadexG-100凝膠柱上，用蒸餾水洗脫，流速為0.3 mL/min，每10 min收集一管。用苯酚-硫酸法在波長490 nm處測定洗脫液吸光度，以吸光度(y)、管號(x)繪制洗脫曲線。

紫外吸收光譜法：配制1.0 mg/mL多糖溶液在200～500 nm范圍內全波長掃描，觀察其在波長260、280 nm附近的吸收峰。

1.3.7 體外抗氧化活性

1.3.7.1 清除DPPH自由基能力測定

參考宋佳敏[12]方法：測定2 mL無水乙醇和2 mLDPPH-乙醇溶液混合液在波長517 nm處的吸光度A0。配制不同質量濃度多糖溶液，加2 mL0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液避光靜置30 min，測定吸光度A1，用無水乙醇代替DPPH-乙醇，測定吸光度A2。以VC為對照，計算清除率：

式中：A0為2 mL無水乙醇+2 mLDPPH-乙醇溶液吸光度；A1為2 mL樣品溶液+2 mLDPPH-乙醇溶液吸光度；A2為2 mL樣品溶液+2mL無水乙醇溶液吸光度。

1.3.7.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

參考王麗波[15]方法：取預熱后4.5 mL(pH 8.2、50 mmol/L)Tris-HCl溶液，加4 mL蒸餾水37 ℃水浴20 min，加0.5 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液水浴20 min，搖勻計時1 min，立刻測定在波長325 nm下吸光度值，每0.5 min測定1次，以10 mmol/L HCl溶液為對照，計算鄰苯三酚自氧化速率v0。取不同質量濃度多糖溶液4 mL代替蒸餾水，以VC為對照，計算鄰苯三酚自氧化速率v1，最后計算清除率：

式中：v0為鄰苯三酚自氧化速率；v1為加多糖后鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.7.3 清除·OH能力測定

參考張昊[16]方法：取不同質量濃度多糖溶液1 mL，加1 mL6 mmol/LH2O2溶液、FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液，40 ℃水浴1 h，在波長510 nm處測定吸光度A1，用蒸餾水代替H2O2溶液測定吸光度A2，用蒸餾水代替多糖溶液測定吸光度A0，計算清除率：

式中：A0為1 mL蒸餾水+1 mLH2O2溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度；A1為1 mL樣品溶液+1 mLH2O2溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度；A2為1 mL樣品溶液+1 mL蒸餾水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度。

1.3.8 數據處理

本實驗均進行3次重復實驗，采用Design-Expert 8.0.6、Origin8.0和excel軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 多糖提取優化

2.1.1 單因素結果

由圖1可知，增加溶劑用量，促進了溶質與溶劑反應，使多糖得率增加，過大溶劑用量可能導致分子間作用力減弱得率下降；隨著超聲時間延長，多糖得率先增加后降低，超過60 min后多糖內部結構遭到破壞得率下降，但在70～80 min，得率回升可能是超

圖1 單因素實驗結果

聲破壞了其他大分子結構使其降解為小分子物質，懸浮在溶液中而使得率增大[17]；超聲溫度過高得率下降，原因是高溫使得溶劑溶出，不利于多糖溶出[18]；超聲功率過大使得其他活性物質散布于溶劑中，影響了多糖溶出。

2.1.2 響應面結果

由表2建立二次元線性回歸方程：Y=5.91+0.22A+0.33B+0.25C+0.18D-0.27AB-0.11AC+0.12AD-0.27BC-0.41BD+0.17CD-0.41A2-0.54B2-0.52C2-0.21D2。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果

圖2 各因素交互作用對SPRP得率影響的響應面圖

表3 Box-Behnken 實驗結果方差分析

2.1.3 各因素交互作用

由圖2a可知，料液比和超聲時間對多糖得率影響呈拋物線，隨著超聲時間的延長得率變化大于料液比，說明超聲時間對多糖得率的影響較大；由圖2d可知，超聲時間和超聲功率對得率影響呈曲面較陡的拋物線，兩者對多糖得率的影響顯著；由圖2e可知，超聲時間和超聲溫度對多糖得率影響呈先升高后平緩，兩者交互作用顯著。由圖2f可知，得率隨著超聲溫度增加先上升后平緩，但隨著超聲功率增大呈拋物線，交互曲面坡度較陡，說明兩者交互作用顯著。經Design-Expert 8.0分析可得最優工藝為料液比1∶17.30(g/mL)、超聲時間57.05 min、超聲功率208.66 W、超聲溫度60 ℃，多糖得率最優值為6.069%。綜合考慮實際因素和實驗準確性，最后確定料液比1∶17、超聲時間57 min、超聲功率209 W、超聲溫度60 ℃，進行3組重復驗證實驗，多糖平均得率為5.926%。

2.2 脫蛋白結果

由圖3可知，綜合考慮蛋白質清除率及多糖損失率，單獨使用TCA法、Sevag法、酶法效果不及Sevag-酶法和Sevag-TCA法，因為兩種方法合用可以起增效作用。但Sevag-TCA法多糖損失率比Sevag-酶法高7.82%，最后選Sevag-酶法脫蛋白，因為酶法中的木瓜蛋蛋白酶可將多糖周圍的蛋白質降解[19]，在酶法基礎上使用Sevag法可以使蛋白質清除率達到76.41%的同時將多糖損失率降到25.69%，時間短且處理次數少。

圖3 脫蛋白方法對SPRP影響

2.3 脫色結果

由圖4可知，活性炭法脫色率62.55%且多糖損失率47.26%，原因是活性炭特異性吸附一些有顏色的色素導致脫色率較低；反膠束法脫色率55.34%且多糖損失率44.38% ，但原料價格昂貴、所用試劑不能回收且脫色率比H2O2法低27.37%。H2O2法可以在脫色率可達82.71%且多糖損失率僅30.03%。因此選用H2O2法脫色，簡單易操作且脫色效果較好。

圖4 脫色方法對SPRP影響

2.4 分級結果

由圖5可知，經DEAE-52纖維素分級后出現了3種較對稱的峰，說明0～1mol/L NaCl的Tris-HCl溶液能較好地分離甘薯渣多糖，分別命名為SPRP-1、SPRP-2和SPRP-3。SPRP-1集中在第10～30管間，SPRP-2集中在第40～45管間，SPRP-3集中在第60～66管間，由于SPRP-2和SPRP-3峰較小即含量較少，接下來的實驗中不予考慮。

2.5 純度鑒定結果

由圖6a可知，經Sephadex G-100洗脫后呈現單一對稱峰，說明經一系列分離純化的SPRP-1為相對分子質量分布均勻且較純的多糖。從圖6b可知，SPRP-1特征吸收峰出現在235 nm，在260 nm和280 nm處沒有出現核酸和蛋白質的特征吸收峰，說明SPRP-1不含核酸和蛋白質等雜質的純多糖。

2.6 抗氧化活性測定結果

由圖7a可知，隨著質量濃度增大，SPRP-1對DPPH自由基清除率逐漸增加，在70 μg/mL后清除率穩定在86%左右。計算得SPRP-1對DPPH自由基的IC50為29.928 μg/mL；從圖7b可知，隨著質量濃度增大，SPRP-1對超氧陰離子自由基清除率增長了44.49%，計算得SPRP-1對超氧陰離子自由基的IC50為0.537 mg/mL；從圖7c可知，質量濃度在0.1-0.6 mg/mL范圍內，SPRP-1對·OH清除率增長了69.68%，計算得SPRP-1對·OH的IC50為0.308 mg/mL。與VC對照可知甘薯渣多糖具有較好的抗氧化活性。

圖5 DEAE-52洗脫曲線

圖6 純度鑒定實驗結果

圖7 抗氧化能力實驗結果

3 結論

目前，甘薯渣中部分可溶性多糖類物質或提取多糖后剩余的不可溶性物質已被初步研究且得率較低，本實驗通過超聲輔助提取甘薯渣多糖最優工藝為：料液比1∶17(g/mL)、超聲時間57min、超聲功率209 W、超聲溫度60 ℃，甘薯渣多糖得率為5.926%。經Sevag-酶法脫蛋白，H2O2法脫色，透析，DEAE-52纖維素分級得含量較多的SPRP-1。且SPRP-1是一種相對分子質量分布均勻、不含蛋白質、核酸并具有較好抗氧化活性的純多糖。