淡豆豉多糖及其酶解產物的理化性質和抗氧活性研究

李朋月 朱艷蘋 國旭丹 景永帥 鄭玉光 吳蘭芳

(河北中醫學院1，石家莊 050200)(河北省中藥炮制技術創新中心2，石家莊 050200)(河北科技大學3，石家莊 050018)

淡豆豉為豆科植物大豆Glycinemax(L.) Merr.成熟種子的發酵加工品，具有良好食用及藥用價值，可治療感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠的癥狀[1]。淡豆豉中含有大豆異黃酮、多糖等活性成分[2]，多糖是由醛基和酮基通過苷鍵連接的高分子聚合物，目前已經有100多種植物多糖被分離出來應用于臨床[3]。

研究表明，經過酶解后的多糖生物活性得到了明顯提高。鄭嵐等[4]通過體外抗氧化實驗表明，經纖維素酶、蝸牛酶和硫酸水解的干巴菌多糖的抗氧化能力顯著增強。多糖酶解主要是通過改變多糖分子質量、分子結構、黏度及取代基的種類、數量和位置以實現其理化性質的改變、生物活性的增強甚至獲得新的生物活性[5]；據文獻報道，植物多糖具有廣泛的生物活性，并表明多糖作為抗氧化劑具有獨特的優勢[6]。目前鮮見淡豆豉多糖進行纖維素復合酶酶解等的相關報道。

本研究主要對淡豆豉多糖進行提取，利用纖維素復合酶進行修飾，并測定淡豆豉多糖及其纖維素復合酶酶解產物的性質及抗氧化活性，以期為淡豆豉多糖及多糖類成分的修飾和淡豆豉活性成分的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡豆豉、纖維素復合酶：食用級；牛血清蛋白、DPPH、Trolox、AAPH、FL、考馬斯亮藍：分析純。

1.2 主要儀器與設備

TH-500型梯度混合器，BT-100B型數顯恒流泵；UV-2550型紫外分光光度儀，3020-425型多功能微孔板讀數儀，1260型高效液相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 淡豆豉預處理

取淡豆豉，粉碎，過40目篩，用95%乙醇回流提取2 h，除去脂溶性成分，藥渣干燥后，備用。

1.3.2 淡豆豉多糖的提取

取除脂后的淡豆豉粉末，加入20倍體積的蒸餾水提取，在超聲波輔助的條件下，55 ℃恒溫提取22 min，離心取上清液。淡豆豉殘渣重復提取1次，合并濾液。將濾液減壓濃縮至一定體積，使用終濃度為80%的乙醇沉淀，抽濾，濾渣揮去酒精后冷凍干燥，得到淡豆豉粗多糖(SSPP)。

1.3.3 淡豆豉多糖的酶解

采用恒溫搖床法進行酶解，精密稱取2 g淡豆豉多糖，放入具塞錐形瓶中，加純水攪拌至溶解，調pH至中性，加12%的纖維素復合酶至溶解，在55 ℃恒溫搖床中反應1 h。

反應后沸水浴滅活10 min，離心，取上清液用終濃度為80%乙醇進行醇沉，4 ℃靜置24 h，抽濾，濾渣揮去酒精后冷凍干燥，得到纖維素復合酶酶解產物SSPP-E。

1.3.4 淡豆豉多糖及其酶解產物糖含量的測定

采用硫酸-苯酚法測定可溶性總糖含量。參照文獻[7]方法進行適當改進制定標準曲線，并按該方法在490 nm處測定樣品的吸光度值，并代入標準曲線計算可溶性糖含量[8]。

1.3.5 淡豆豉多糖及其酶解產物蛋白質含量的測定

參照文獻利用考馬斯亮藍法測定SSPP及SSPP-E中蛋白質含量[8]。

1.3.6 淡豆豉多糖及其酶解產物的紫外-可見光譜分析

精確稱取SSPP及SSPP-E樣品各1.0 mg，用少量蒸餾水溶解，定容至10 mL的容量瓶中，使其配成質量濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液，在200～800 nm波長處進行掃描[9]。檢測多糖中是否具有核酸和蛋白質的特征吸收峰。

1.3.7 淡豆豉多糖及其酶解產物的紅外光譜分析

精確稱取1.0 mg的SSPP及SSPP-E樣品，以KBr混合研磨成極細粉末，壓片，在4 000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描[10]。檢測樣品中是否存在多糖的特征吸收峰。

1.3.8 淡豆豉多糖及其酶解產物的單糖組成分析

參照文獻對淡豆豉多糖及其酶解產物的單糖組成進行測定[11,12]。

1.3.9 淡豆豉多糖及其酶解產物的抗氧化活性測定

1.3.9.1 DPPH活性的測定

參照Karagozler A A等[13]的方法。

1.3.9.2 羥基自由基的測定

參考許效群等[14]方法。將每個樣品濃度平行測定3次，計算平均值，通過式(1)計算清除率：

(1)

式中：K為清除率/%；A1為多糖樣品的吸光度；A2為本底吸光度；A0為空白對照的吸光度。

1.3.9.3 ORAC的測定

參考Lin Lianzhu等[15]方法進行測定。ORAC實驗需要設定兩種對照，即沒有添加AAPH的FL熒光自然衰減對照和沒有抗氧化劑存在時的AAPH作用對照。

樣品的抗氧化能力與自由基作用下熒光衰退曲線的延緩部分面積(Net AUC)直接相關[16]，計算ORAC值。

(2)

2 結果

2.1 淡豆豉多糖的提取率

除脂后的淡豆豉粉末經超聲波輔助水提后，用乙醇沉淀，沉淀干燥得到淡豆豉粗多糖(SSPP)，提取率為4.59%。

2.2 淡豆豉多糖的酶解得率

取2 g的SSPP通過纖維素復合酶進行恒溫搖床酶解，得到SSPP-E，酶解得率為58.0%。

2.3 可溶性總糖含量測定

以葡萄糖做標準品，通過曲線得回歸方程為y=12.1x+0.151 6 (R2=0.992 7)，通過計算可得，SSPP和SSPP-E可溶性總糖含量分別為68.88%和55.08%。

2.4 蛋白含量的測定

以牛血清蛋白做標準品，得方程y=7.312 9x+0.703 5 (R2=0.992 0)，SSPP和SSPP-E的蛋白含量分別為4.03%和0.19%。

2.5 紫外-可見光譜分析

由圖1可知，吸收峰主要在260～280 nm之間，說明SSPP、SSPP-E內可能含有少量蛋白質或核酸等成分，和蛋白測定結果相一致。

圖1 SSPP和SSPP-E的紫外-可見光譜結果圖

2.6 紅外光譜分析

圖2 SSPP和SSPP-E紅外光譜結果圖

2.7 SSPP和SSPP-E的單糖組成分析

為了進一步研究酶解前后的單糖組成變化，采用PMP衍生化HPLC法進行單糖組成測定。

根據圖3～圖5可知，SSPP單糖組成的摩爾比∶甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖為0.05∶0.14∶0.13∶0.26∶0.18∶0.24；SSPP-E單糖組成的摩爾比∶甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖為0.08∶0.18∶0.12∶0.18∶0.21∶0.23。從單糖組成來看，組成SSPP和SSPP-E的單糖組成一致，但是單糖的摩爾比發生了變化，甘露糖、葡萄糖、木糖的含量增加，葡萄糖、半乳糖含量減小，阿拉伯糖量基本不變。這可能是因為在酶解修飾過程中，一些支鏈從糖鏈上斷裂，導致單糖比例發生變化。

注：1 甘露糖；2 鼠李糖；3 半乳糖醛酸；4 葡萄糖醛酸；5 葡萄糖；6 半乳糖；7 木糖；8 阿拉伯糖；9 果糖。圖3 標準品的PMP衍生物HPLC圖譜

注：1 露糖；2 葡萄糖醛酸；3 葡萄糖；4 半乳糖；5 木糖；6 阿拉伯糖。圖4 SSPP的PMP衍生物HPLC圖譜

注：1 甘露糖；2 葡萄糖醛酸；3 葡萄糖；4 半乳糖；5 木糖；6 阿拉伯糖。圖5 SSPP-E的PMP衍生物HPLC圖譜

2.8 淡豆豉多糖及酶解產物的抗氧化活性測定

2.8.1 清除DPPH自由基活性

由圖6可知，在一定的質量濃度范圍內，樣品質量濃度和清除率成一定的量效關系。在濃度為4 mg/mL時SSPP清除率為41.95%，SSPP-E的清除率為55.20%。通過計算IC50值得出，SSPP的IC50值為4.842 mg/mL，SSPP-E的IC50值為3.574 mg/mL，通過方差分析表明P<0.001，具有極顯著差異，說明酶解有利于提高淡豆豉多糖清除DPPH自由基的活性。

圖6 SSPP和SSPP-E清除DPPH自由基活性結果圖

2.8.2 清除羥基自由基的活性

由圖7可知，在一定的質量濃度范圍內，樣品質量濃度和清除率成正比關系，各樣品均呈現良好的線性關系。濃度為1.8 mg/mL時，SSPP的清除率為82.52%，SSPP-E為84.22%。田崇梅等[18]在黃芪多糖體外抗氧化性研究中得出當蒙古黃芪多糖的質量濃度為2 mg/mL時其清除率為85%，其研究與本實驗結果相差不大。通過計算IC50值得出，SSPP的IC50值為1.099 mg/mL，SSPP-E的IC50值為1.041 mg/mL，通過方差分析無顯著性差異(P>0.05)，說明在清除羥基自由基的活性時，淡豆豉多糖酶解產物與未酶解組差異不大。

圖7 SSPP和SSPP-E清除羥基自由基活性結果圖

2.8.3 ORAC的測定

對ORAC測定運用統計分析，采用Origin 8.0軟件作圖分析。

圖8 不同濃度的Trolox熒光衰退動力學曲線圖

通過計算不同摩爾濃度的Trolox與凈AUC值之間的線性關系得到方程：y=0.312 4x-1.625 9(R2=0.995 2)，由結果可知標準曲線的相關性較高。

表1 SSPP和SSPP-E的ORAC值

由表1可以看出，酶解后有利于ORAC值的升高，在樣品質量濃度為0.005 mg/mL時，SSPP和SSPP-E的ORAC值分別為1 492.16和2 123.90 μmol TE/g，方差分析表明P<0.001，具有極顯著差異，從結果可以看出，酶解有利于淡豆豉多糖氧自由基吸收能力的提高。

通過抗氧化活性測定結果表明：SSPP經過酶解后，其抗氧化活性得到增強。

3 結論

通過提取淡豆豉多糖，并對其進行酶解，通過比較酶解前后的理化性質及體外抗氧化活性得出：1)SSPP和SSPP-E均具有多糖的典型特征吸收峰，經過酶解后，SSPP-E的可溶性總糖含量、蛋白含量、單糖組成的摩爾比發生了變化。2)經過酶解后，體外抗氧化活性得到一定程度的提高。

淡豆豉多糖經過酶解后其體外活性有所提高，可能是因為部分蛋白被除去，暴露了更多的活性基團(如葡萄糖醛酸或其他結合的小分子化合物)，或者是酶解使得淡豆豉降解為分子質量較低的多糖，分子質量減小之后有利于多糖空間結構的舒展和與自由基的結合，提高抗氧化的能力，但具體的性質與活性之間的關系如何，有待進一步研究。