蒸汽爆破-超微粉碎米糠膳食纖維對2型糖尿病小鼠的降血糖作用

徐田輝 蘇 玉 黃 亮 付曉康 賀 便

(特醫(yī)食品加工湖南省重點實驗室；中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院1，長沙 410004)(稻谷及副產(chǎn)品深加工國家工程實驗室；中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院2，長沙 410004)

米糠是從糙米精制中得到的副產(chǎn)物，由大多數(shù)皮層、胚胎、糊粉層和少量的胚乳組成，約占水稻總質(zhì)量的10%[1]。中國年產(chǎn)米糠約1 200萬t，但綜合利用率低，有效利用率低于20%。米糠除了含有脂肪、多糖、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)外，其膳食纖維含量也較為豐富。膳食纖維可以降低冠心病、糖尿病和肥胖的風險，攝入足夠的膳食纖維還可以幫助降低便秘、憩室病和其他消化道疾病的發(fā)生率[2]。

蒸汽爆破是一種較新的食品加工技術(shù)，采用高溫高壓蒸汽處理纖維原料，通過瞬時減壓過程實現(xiàn)原料的成分分離[3]。與其他預(yù)處理方法相比，蒸汽爆破可以顯著降低能耗與成本，減少危害[4]。白曉洲等[5]的研究表明，蒸汽爆破法可顯著提高沙棘中可溶性膳食纖維的含量；康芳芳等[6]的研究表明，蒸汽爆破可以顯著提高豆渣中可溶性膳食纖維的含量。

膳食纖維的生理作用早已引起人們的關(guān)注，它可以通過各種機制改善2型糖尿病患者的血糖、血脂和體重[7]。因此，合理使用膳食纖維對糖尿病患者的飲食治療非常有益。世界衛(wèi)生組織和歐洲食品安全局都建議在日常飲食中加入一定量的膳食纖維。膳食纖維改善糖尿病患者病情然后發(fā)揮治療作用的機制尚不十分清楚，然而，膳食纖維是腸道中有益細菌的食物來源，補充攝入膳食纖維可以增強人體有益腸道菌群的代謝，并產(chǎn)生多種有益的生物活性物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)人體新陳代謝。因此，膳食纖維對糖尿病和相關(guān)病癥的有效控制可能與有益腸道菌群的代謝調(diào)節(jié)有關(guān)[8,9]。

在初步的基礎(chǔ)研究中，發(fā)現(xiàn)米糠膳食纖維在蒸汽爆破-超微粉碎復(fù)合改性后具有良好的膨脹性，保水能力和脂肪吸收能力[10,11]。因此，為了研究米糠膳食纖維是否可以降低2型糖尿病小鼠的血糖水平，將經(jīng)過蒸汽爆破-氣流粉碎復(fù)合改性和蒸汽爆破-納米粉碎復(fù)合改性的米糠膳食纖維懸浮于蒸餾水中，并采用高糖高脂飲食和低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型，分析不同改性方法的米糠膳食纖維對2型糖尿病小鼠血糖水平、血脂水平、肝臟和胰腺組織的影響，為米糠膳食纖維改善2型糖尿病提供參考[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

50只體重18～26 g的BALB/c小鼠雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，無特定病原體(specific pathogen free, SPF級，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2016-0002)，動物飼養(yǎng)許可證號：SYXK(湘)2014-0012。

基礎(chǔ)飼料：蛋白質(zhì) 35.6%、脂肪 44.3%、碳水化合物 20.1%；高糖高脂飼料：基礎(chǔ)飼料63.6%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、蛋黃粉10%、蔗糖15%、豬油10%。

經(jīng)蒸汽爆破超微粉碎復(fù)合改性得到的兩種不同粒徑的米糠膳食纖維：蒸汽爆破-氣流粉碎米糠膳食纖維和蒸汽爆破-納米粉碎米糠膳食纖維。

鹽酸二甲雙胍緩釋片(95%純度)、鏈脲佐菌素(98%純度含異構(gòu)體)、A111-2型總膽固醇(分析純)、A112-1型高密度脂蛋白膽固醇(分析純)、A113-1型低密度脂蛋白膽固醇(分析純)、A110-1型總甘油三酯(分析純)、A-001-1型超氧化物歧化酶(酶活≥2 500 u/mg)、A003-1型丙二醛(分析純)、A043型肝糖原(分析純)和A045-2型考馬斯亮藍G-250測定試劑盒(分析純)。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

DHG-92425A鼓風干燥箱，F(xiàn)E20K數(shù)字式pH/mv計校準儀，722分光光度計，DNM-9602A酶標儀，TG16KR臺式高速冷凍離心機，GA-3型血糖儀，GA-3型血糖試紙。

1.3 方法

1.3.1 米糠膳食纖維的獲取與復(fù)合改性

將脫脂米糠在60 ℃下干燥，通過100目篩壓碎，調(diào)節(jié)至pH4.5，并在60 ℃的水浴中攪拌2 h與蒸餾水以1∶12(m∶V)的比例混合煮沸30 min，將溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，然后加入0.3%的熱穩(wěn)定α-淀粉酶(耐高溫)，并在95 ℃下酶水解持續(xù)30 min[13]。將溶液調(diào)至pH7.5，然后加入0.6%堿性蛋白酶，在60 ℃溫度下酶水解2 h，酶在水浴中冷卻至室溫，最后將濾液干燥，得到米糠膳食纖維。將制得的米糠膳食纖維通過蒸汽爆破-氣流粉碎和蒸汽爆破-納米粉碎進行改性，分別得到兩種復(fù)合改性米糠膳食纖維粉[14]。

1.3.2 電子掃描顯微鏡測量復(fù)合改性后的米糠膳食纖維粒徑并確定其結(jié)構(gòu)

取適量干燥樣品，用導(dǎo)電膠將其固定在樣品臺上，噴金100 s加速電壓從低到高逐漸上升到5 kV，工作距離為10 mm在不同的放大倍數(shù)下觀察樣品顆粒的形態(tài)，并分析樣品的形態(tài)，分別測量兩種復(fù)合改性米糠膳食纖維中各組分的含量[15]。

1.3.3 小鼠高糖高脂模型的建立

選取50只18～26 g SPF級BALB/c小鼠雌雄各半，先用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱量體重，分性別按體重隨機分為10組，每組5只，其中雌、雄的第1組喂基礎(chǔ)飼料，其余8組喂高糖飼料并分性別對小鼠進行編號后繼續(xù)喂養(yǎng)3周后，禁食12 h，造模組腹腔注射1% 鏈脲佐菌素溶液(60 mg/kg b.w)，連續(xù)注射3d，對照組腹腔注射相同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液[16]。

鏈脲佐菌素注射5～7 d后禁食3～5 h，尾部取血測空腹血糖值，選取血糖水平大于11.1 mmol/L的小鼠建立糖尿病動物模型。

1.3.4 小鼠的分組及給藥

造模成功小鼠按性別隨機分成8組，即基礎(chǔ)對照組、高糖模型組、陽性對照組、糖尿病灌胃蒸汽爆破-氣流粉碎組和糖尿病灌胃蒸汽爆破-納米粉碎組，剪腳趾進行編號。其中基礎(chǔ)對照組繼續(xù)喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，高糖模型組繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料。基礎(chǔ)對照組和高糖模型組小鼠每天灌胃蒸餾水(20 mL/kg)；陽性對照組每天灌胃鹽酸二甲雙胍緩釋片溶液(7.5 mg/mL)；蒸汽爆破-氣流粉碎組和蒸汽爆破-納米粉碎組分別每天灌胃蒸汽爆破-氣流粉碎、蒸汽爆破-納米粉碎加純凈水配制成濃度為0.14 g/mL的懸浮液(均為現(xiàn)用現(xiàn)配)，灌胃體積22 mL/kg。連續(xù)灌胃4周，期間自由攝食、飲水。灌胃期間每天觀察記錄小鼠的攝食狀況、精神狀態(tài)、毛發(fā)情況。4周結(jié)束后禁食不禁水12 h，小鼠摘眼球取血，分離血清測定血脂水平。全部小鼠脫臼處死迅速解剖取肝臟、胰腺組織等器官觀察并稱重，其余部分于-80 ℃冰箱中待分析[17,18]。

1.3.5 小鼠血糖水平的測定

每周第7天上午10:00測定小鼠空腹血糖值，將灌胃前后各組小鼠的空腹血糖值與模型對照組進行配對分析。

1.3.6 小鼠肝臟總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、丙二醛、超氧化物歧化酶值以及肝糖原的測定

取0.5 g肝臟組織塊剪碎置于玻璃勻漿管中，加入4.5 mL 0.86%冷生理鹽水進行勻漿，將制備好的10%勻漿用離心機2 000 r/min左右離心10～15 min，取上清液于EP管中待測，采用酶學方法檢測肝臟組織中總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的含量[19]。

按試劑盒要求，分別檢測肝臟中丙二醛、超氧化物歧化酶以及糖原含量，具體操作按試劑盒說明進行。

表1 米糠膳食纖維的成分表/g/100 g

1.3.7 小鼠肝臟及胰腺組織形態(tài)學觀察

將小鼠肝臟及胰腺組織用9%中性福爾馬林固定48 h，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，透蠟，包埋，脫蠟切片，蘇木精-伊紅(HE染色)，顯微鏡觀察肝臟及胰臟組織結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種復(fù)合改性米糠膳食纖維的電鏡掃描

從圖1中可以看出，在60倍和10k鏡頭下，蒸汽爆破-納米粉碎的粒徑小于蒸汽爆破-氣流粉碎粒徑，粒度分布相對均勻。米糠膳食纖維的基本組成如表1所示，經(jīng)過蒸汽爆破-超微粉碎的米糠膳食纖維，其可溶性膳食纖維的含量明顯增加，且經(jīng)過蒸汽爆破-納米粉碎的米糠膳食纖維，其可溶性膳食纖維的含量增加更明顯。

注：1:蒸汽爆破-氣流粉碎, 2:蒸汽爆破-納米粉碎, a:×60 倍鏡, b:×10k倍鏡。圖1 米糠膳食纖維掃描電鏡圖

2.2 米糠膳食纖維對小鼠血糖水平的影響

通過小鼠血糖含量變化分析比較由圖2可知，糖尿病小鼠的血糖水平明顯升高，說明造模成功；灌胃初期，陽性對照組血糖明顯降低，說明受到陽性藥物的治療有明顯的效果，米糠膳食纖維組在灌胃初期無明顯效果，但在后期血糖有一定程度的降低，并低于高糖模型組；陽性對照組、蒸汽爆破-氣流粉碎組、蒸汽爆破-納米粉碎組在實驗結(jié)束時的血糖值，雌鼠分別比之前降低了18.3%、4.9%和6.4%，雄鼠分別比之前降低了18.4%、4.2%和13.2%，說明米糠膳食纖維有降血糖的作用，這是因為在溶液中有較大黏性的水溶性膳食纖維能將葡萄糖分子包裹在其中，從而降低小鼠對葡萄糖的吸收，且改性處理后的米糠膳食纖維中的水溶性膳食纖維含量顯著增加，有效提高了小鼠對葡萄糖的吸附能力。從圖2可以看到米糠膳食纖維干預(yù)組的降血糖效果相比于對照組來說降幅不是很明顯，可能是因為所灌胃的米糠膳食纖維的濃度太低，但是從宏觀上來說，其確實對于小鼠起到了一定的降血糖作用，這與李耀東等[20]的研究結(jié)果一致。說明米糠膳食纖維有助于延緩和降低餐后血糖，升高血清胰島素水平，維持餐后血糖的平衡和穩(wěn)定，避免血糖水平的劇烈波動。

圖2 米糠膳食纖維對小鼠血糖水平的影響

2.3 米糠膳食纖維對小鼠生理指標的影響

由圖3可知，與基礎(chǔ)對照組相比，糖尿病對照組的小鼠肝臟中的總甘油三酯、總膽固醇均顯著升高，糖尿病小鼠多伴發(fā)血脂代謝紊亂，且高糖高脂飲食會增加小鼠的肝臟脂質(zhì)水平，促使脂肪肝的形成。雖然米糠膳食纖維干預(yù)組的血脂水平未能達到基礎(chǔ)對照組，但是已經(jīng)顯著降低了小鼠血清的總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的濃度，并且隨著米糠膳食纖維粒度的減小，其血脂濃度逐漸降低，其中蒸汽爆破-納米粉碎組小鼠血脂水平較高糖模型組下降顯著，說明了蒸汽爆破-納米粉碎組有較好的吸附膽固醇的功效。張薇等[21]研究表明燕麥膳食纖維對小鼠腸道中的膽固醇具有一定的吸附作用，與本研究結(jié)果一致。

從圖3中可以看出，患糖尿病的小鼠的超氧化物歧化酶活力明顯低于基礎(chǔ)對照組，其中高糖模型組差異極顯著(P<0.01)，表明高糖高脂飲食降低了機體抗氧化能力，陽性對照組、蒸汽爆破-氣流粉碎組和蒸汽爆破-納米粉碎組小鼠的肝臟超氧化物歧化酶酶活性與DC組相比均極顯著提高(P<0.01)，分別是高糖模型組的258.52%和237.30%(陽性對照組雌性和雄性)、234.01%和207.52%(蒸汽爆破-氣流粉碎組的雌性和雄性)、255.32%和213.33%(蒸汽爆破-納米粉碎組的雌性和雄性)，可以看出米糠膳食纖維干預(yù)組中，蒸汽爆破-納米粉碎組的干預(yù)效果最理想，對肝組織的保護最明顯，且該組小鼠的超氧化物歧化酶的活力與基礎(chǔ)對照組之間不存在顯著性差異(P>0.05)。

由圖3可知，高糖模型組小鼠的肝臟中丙二醛的含量與基礎(chǔ)對照組相比極顯著性增加(P<0.01)；與高糖模型組相比，干預(yù)組雌性小鼠的丙二醛值均顯著下降(P<0.05)，雄性小鼠呈極顯著下降(P<0.01)，這表示米糠膳食纖維能有效的清除體內(nèi)的自由基，抑制脂質(zhì)的過氧化；由圖3分析可知，米糠膳食纖維干預(yù)組均有較強的清除自由基的能力，效果均較為明顯。但馬正偉等[22]的研究表明，長期高劑量的復(fù)合膳食纖維會導(dǎo)致高脂血癥大鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，且有不良影響。本研究所灌胃的米糠膳食纖維為復(fù)合型膳食纖維，但其劑量相對于小鼠仍較低，但不排除其對小鼠肝臟的損壞作用，后期還需在高劑量方面展開一定的研究。

注：不同的符號表示存在顯著性差異。

圖4 米糠膳食纖維對小鼠胰腺組織的影響

2.4 米糠膳食纖維對小鼠肝糖原的影響

由表2可知，患糖尿病的小鼠體內(nèi)肝糖原的含量均低于正常小鼠，高糖模型組與基礎(chǔ)對照組相比較差異顯著(P<0.05)，雄性小鼠陽性對照組、蒸汽爆破-納米粉碎組較高糖模型組差異顯著(P<0.05)，但雌性各組除陽性對照組外均不顯著，可能是因為而動物肝糖原的分析結(jié)果直接受到動物的生理習性、樣品放置時間、提取方式等因素的影響。

表2 米糠膳食纖維對小鼠肝糖原含量的影響

2.5 米糠膳食纖維對小鼠肝臟組織的影響

通過解剖發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)對照組小鼠的肝臟正常，外觀光滑，分葉清晰，大小正常，顏色呈鮮紅色。高糖模型組肝臟腫大，色澤發(fā)黃變白。與高糖模型組相比，陽性對照組、蒸汽爆破-氣流粉碎組和蒸汽爆破-納米粉碎組小鼠的病變均有所減輕。但蒸汽爆破-納米粉碎組相對于陽性對照組以及蒸汽爆破-氣流粉碎組，其肝臟更加飽滿，且色澤均勻，無紅色淤血情況出現(xiàn)，這種情況可能是陽性對照組在給藥的同時，藥物存在一定的副作用，對小鼠肝臟有輕微的損傷作用。

2.6 米糠膳食纖維對小鼠胰腺組織的影響

由圖4可知，基礎(chǔ)對照組(a♀)和(a♂)胰腺組織結(jié)構(gòu)清楚，可以觀察到完整的胰島結(jié)構(gòu)，胰島呈圓形且數(shù)量較多、無脂肪增生、沒有出現(xiàn)充血、炎癥等組織病變；而糖尿病對照高糖模型組(b♀)和(b♂)，小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)不清晰、胰島排列混亂、血管舒張、充血和壞死，出現(xiàn)嚴重的病理學變化；與高糖模型組相比，干預(yù)組的胰腺組織情況較為良好，雖也出現(xiàn)了不同程度的充血和壞死等病變，但程度明顯較輕，其中陽性對照組(c♀)和(c♂)只有較輕的表面脂肪組織增生，蒸汽爆破-納米粉碎組(e♀)和(e♂)的胰腺組織與高糖模型組小鼠相比，胰島細胞數(shù)量增多，大部分腺末房細胞未見腫脹。佐兆杭等[23]的研究表明，雜豆膳食纖維能夠通過所干預(yù)的組分中多糖的直接作用，提高大鼠機體內(nèi)抗氧化活性酶的間接作用，從而起到對胰腺的修復(fù)作用。本研究所灌胃干預(yù)的米糠膳食纖維中，蒸汽爆破-納米粉碎組中膳食纖維的可溶性膳食纖維組分較蒸汽爆破-氣流粉碎組高，其所含的多糖組分也較高，其對胰腺組織的保護作用也相對較強。

3 結(jié)論

利用不同復(fù)合改性處理的米糠膳食纖維干預(yù)2型糖尿病小鼠，通過對糖尿病小鼠的各項生理指標的測定，研究米糠膳食纖維對2型糖尿病小鼠血糖水平的影響。改性后的米糠膳食纖維中的水溶性膳食纖維含量顯著增加，有效提高樣品對葡萄糖吸附能力；同時米糠膳食纖維有效降低了小鼠體內(nèi)的血脂水平，并對其肝臟及胰腺組織的病變有很好的改善，胰島發(fā)炎癥狀也逐漸好轉(zhuǎn)。病理切片中兩種不同粒徑的米糠膳食纖維相較，可以看出復(fù)合改性后的米糠膳食纖維組的細胞形態(tài)較為規(guī)律完整，表明米糠膳食纖維能有效減少高糖高脂飲食造成的肝臟組織病變形成的脂肪空泡和胰腺組織胰島的充血和壞死，保護機體，且經(jīng)蒸汽爆破-納米粉碎復(fù)合改性米糠膳食纖維較蒸汽爆破-氣流粉碎米糠膳食纖維，對2型糖尿病小鼠機體的保護作用效果更明顯。