重組蛋白類藥物蛋白含量測定方法探究

李昊娜，許宏

（1.上海健康醫學院，上海 201318；2.甘肅省武威市天祝藏族自治縣第一中學，甘肅 武威 733200）

0 引言

重組蛋白是以重組DNA 或重組RNA 技術為基礎而獲得的一種蛋白質，重組蛋白類藥物的研制與應用，為很多患者疾病治療過程中帶來了“曙光”，并且在政策、市場需求等因素的作用下，重組蛋白類藥物的發展逐漸步入至“黃金時期”。加強重組蛋白類藥物質量控制，是其是否能成功、順利上市的決定因素[1]。蛋白含量檢測是重組蛋白類藥物質控的關鍵內容之一，但部分工作人員還不能嫻熟操作相關方法，鑒于此本文對幾種蛋白測量的常規方法作出探究。

1 重組蛋白類藥物

重組蛋白類藥物可以被視為由基因工程技術整改的“工程菌”或者是“工程細胞”大量表達出的機體功能性蛋白或相應的突變體，這樣機體因為先天基因缺陷或后天性疾病等引起的對應功能蛋白缺失便實現了有效“補救”。既往國內外有很多學者指出[2]，建設完善化的質控體系有益于掃平重組蛋白類藥物上市過程中的各類障礙，而蛋白含量檢測是該類藥物質控體系的關鍵指標之一，和活性測算、殘余雜質控制及成品分裝相比較，蛋白含量檢測具有更大的現實意義。

2 蛋白定量檢測的常規方法

2.1 標準定量法

①凱氏定氮法:使用該種方法檢測藥物蛋白含量，是基于分析含氮量進行的，反應進行過程中耗損掉的鹽酸滴定液可以追溯到質量恒定時無水碳酸鈉對應重量，可以將其設為含量標準品追溯始源的手段。大部分情況下，充足蛋白類藥物的純度處于較高水平，采用該種方法測量蛋白含量，不必顧慮他類含氮物質對測量結果精度形成的影響。但是若在制劑期間采用了含氮添加劑，則此時蛋白含量是總氮量與非蛋白氮量兩者的差值。因為凱氏定氮法是利用含氮量將蛋白含量換算出來，在具體實踐中應結合蛋白分子式準確計算出換算系數F。

②氨基酸分析法:該定量檢測方法的功能在于能測量出構成蛋白質的各種氨基酸所占比重。在具體檢測時，通常會應用以液相為基礎的常規酸解法。先對蛋白樣品實施酸水解處理，由此獲得游離氨基酸溶液，繼而在異硫氰酸苯酷（PITC）的協助下實現柱前衍生，此時氨基酸附帶了疏水結構和吸收基團，最后在液相的支撐下實現精確分離與檢測。這在計算環節中，建議先使用混標實現對各個氨基酸的定量，再利用多個公式測得蛋白含量指標。因為各氨基酸的水解程度存在差異，為保證蛋白含量檢測結果的精確度，建議計算在水解內穩定、在蛋白內含量較高、分離度與回收率較高的氨基酸中進行。凱氏定氮法和氨基酸分析法均是當下國內外認可的檢測蛋白含量“金標準”[3]，前種方法使用時最大的不足是需要投放較多的樣品，一次測量大概耗損20 mg蛋白，而后者不適用于測量高度糖基化蛋白樣品的蛋白含量。

2.2 比色分析法

已有大量研究證實[4]，Lowry 法、雙縮脈法、BCA法及Bradford 法均是基于蛋白內特殊氨基酸或基團的呈色反應，采用對比顯色深度的形式確定蛋白含量。應用該種方法測量蛋白含量時，選擇適宜的標準樣品是影響定量檢測結果精確度的重要因素。以往通常會將牛血清白蛋白、人白蛋白設為替代標準品對蛋白含量定量檢測，但不同蛋白的氨基酸分子構成、理化性質存在差異，很可能形成偏差，故而不能真切的呈現出待測樣品的實際含量。

筆者認為，只有應用和待檢樣品材質等同的原料，并將其設為標準品，打造同質標準品，方可規避由以上情況產生的偏差。但是針對初期研發的種族蛋白藥物，獲取同質標準品存在較大難度，這在很大程度上限制了該種方法的推廣。但是若能獲取同質標準品，通過“標準定量法”對其進行標定處理以后，便可以采用該類方法常規檢測蛋白含量。

另外，和其他方法相比較，比色分析法在使用過程中形成的蛋白一染料復合物的消光系數處于較高水平，這有益于提升檢測結果的靈敏度，故而該種方法在蛋白質微量檢測領域體現出良好效能。但多種干擾物質會干擾這種方法的應用過程，故而應以最嚴謹的態度加以選擇應用。

2.3 紫外吸收法

因為Trp、Tyr 及Phe 結構內苯環含有共扼雙鍵，故而蛋白質在280 nm 位置的紫外形成了吸收特勝。依照朗伯一比爾定律，在光程和消光系數已知條件下，采用檢測蛋白樣品280 nm 處OD 指標的形式，就可以檢測到蛋白含量。故而，采用該種方法檢測過程中，怎樣科學確定曉光系數是需重點考慮的問題之一。歷經周密性的文獻調查研究，本文把當下確定蛋白消光系數的方法總結為如下四種類型，涵蓋了一種經驗公式法與三種試驗檢測法。

（1）經驗公式法。EDELHOCH[5]提出并證實了在6mol/L 鹽酸胍變性處置條件下，Trp、Tyr、S-S 模型化合物可用于等同條件下他類非折疊蛋白的消光系數。為能精確測算出臨近自然折疊狀態下蛋白質對應的消光系數，PACE 等[6]對公式內三種氨基酸的消光系數予以校正處理，并賦予新值，最后獲得了（1）式:

其中，5500、1490、125 對應的依次是Trp、Tyr、S-S校正處理后的摩爾消光系數。

基于該種方法獲得的消光系數一般被統一稱之為理論消光系數，其和鹽酸胍變性法獲得的消光系數偏差約為4.0%。蛋白質氨基酸構成內色氨酸含量高低是影響偏差值高低的主要因素，偏差大小和色氨酸含量間呈反比例關系。若蛋白質氨基酸構成內無色氨酸，則偏差值通常＞10.0%，對其成因加以分析，主要和色氨酸消光系數偏高、對蛋白于280nm 位置吸光度貢獻偏大存在相關性，并且診斷酸堿度、溫度條件改變過程均沒有表現出較高敏感性。

（2）鹽酸胍變性法。盡管該方法也是基于Edelhoch構建了Trp、Tyr、S-S，但和經驗公式法相比較，該法應用階段分析了氨基酸周遭環境對其吸收值高低形成的影響，這提示利用該種方法檢測到消光系數和自然折疊狀態下蛋白質的消光系數相似度更高。

為方便理解，筆者在這里簡要闡述如下操作方法:首先把同一蛋白溶液均等的氛圍兩種，一份加入6mol/L 鹽酸胍溶液（將其標記成6MG），另一份加入等體積的配方緩沖液，有cnat=C6MG，也有ε280nat=ε280 6MG ×Anat/A6MG。其中，有ε280 6MG=a×εTyr+b×εTrp+c×TrpCystina=a×1285+b×5685+c×125。最終獲得配方緩沖液內天然態對應的消光系數用公式（2）表示[6]:

其中，1285、5685、125 對應的是6mol/L 鹽酸胍溶液內Trp、Tyr、S-S 于280 nm 位置的摩爾消光系數。

（3）堿水解法。Goodwin、Morton 共同建設以基于堿水解條件下的二元模型，等同于蛋白質在0.1 mol/L NaOH 溶液內發生堿性水解反應，可以將蛋白質溶液視作為Trp 與Tyr 的二元體系 。具體操作方法和鹽酸胍變性法之間有很大相似處，最后獲得配方緩沖液內天然態蛋白的消光系數用（3）式表示:

1576、5250 對應是分別是0.1mol/L NaOH 溶液內Trp、Tyr 于280nm 位置的摩爾消光系數。

（4）氨基酸分析法。可以利用蛋白質的序列信號捕獲消光系數，也可以通過測算相關蛋白的氨基酸分析結果獲得。盡管前種方法應用流程更具簡潔性，但現實應用中也有很大局限性，這主要是由于在蛋白成品制劑內，摻和輔助用料以及添加劑，能驅動供試樣品酸堿度（pH值）發生改變過程，對酪氨酸殘基的離子態形成一定影響，進而作用于蛋白吸光度指標。這就預示著采用氨基酸分析法能獲得精確度更高的消光系數。

該法先利用氨基酸分析法定量檢測蛋白，而后基于朗伯-比爾定律測得精確度較高的消光系數，即為公式（4）[7]:

和其他幾種方法相比較，紫外線吸收法具有操作過程簡易、資金投入量少、不形成污染、定量檢測后樣品可以回收使用等諸多優勢。采用經驗公式法、鹽酸胍變性法、氨基酸分析法及堿水解法能較準確的測定蛋白消光系數，彌補了蛋白定量不精確的缺陷。另外，利用基因重組技術制得的重組蛋白類藥物，序列信息大體上是已知的，這在很大程度上降低了消光系數獲得的難度，這也是紫外線法在重組蛋白類藥物蛋白含量檢測中廣泛應用的主要原因之一。但是針對蛋白結構內無色氨酸、酪氨酸的重組蛋白類藥物，紫外線吸收法不能體現出良好適用性。

在確定消光系數過程中，應予以如下問題一定重視:經驗公式法應用過程中無需開展實驗操作，僅需明確蛋白內Trp、Tyr、S-S 數目就能測算出消光系數，也可以把DNA 序列輸送至生物信息學軟件（ExPASy）直接捕獲，但是缺點是該種方法在很大程度上沒有考慮蛋白三維空間結構對消光系數做出的貢獻。而三種實驗檢測法較好的彌補了該方面存在的不足，都分析到蛋白空間結構形成的影響，故而測算出的消光系數合自然折疊狀態毗鄰度更高，特別是利用氨基酸分析法能獲得準確度更高的消光系數。故而，推薦在現實運用階段，增設了對消光系數的試驗證實與對比過程。

3 紫外吸收法檢測ADC的蛋白含量

ADC 是由單抗、連接子及小分子藥物共同構成組裝體，單抗于280 nm 位置形成紫外吸收狀況之外，小分子藥物通常也會形成較明顯的紫外吸收情況。故而，若直接采用單抗消光系數去測算ADC 的蛋白含量，結果精確度并不高。

本文在這里提及的內容是，朗伯一比爾定律對單組分體系的適用性欠佳，而在多組分體系內體現出較好的效能，若已知這些組分存有不同的吸收光譜并且組分間未形成相互作用，則在設定的波長（λ）下，該溶液對應的總吸光度是各組分單個吸光度之和可用（5）表示[8]:

結合以上原理，抗體在280 nm 處形成特征性吸收峰，基于此形成特定的消光系數E280 mAb，小分子藥物在其吸收波長最大值位置存有特異性吸收峰，也會形成特定的消光系數Eλ（D） drug。同理，抗體與波長λ（D）有對應的消光系數E}λ（D） mAb，小分子藥物于280 nm 波長處存有消光系數E280 drug。針對ADC 于280 nm 及λ（D）波長處形成的吸收值分別檢測，能夠求算出抗體濃度[6]。

除此之外，如果小分子藥物與連接子于280 nm 位置均未產生吸收現象，則兩者形成的影響可以忽略不計，這提示可以直接采用單抗的消光系數測算出ADC的蛋白含量。該種方法也經常被用來檢測ADC 藥物的DAR 值。

4 結論

本文闡述了當下檢測重組蛋白類藥物蛋白含量的常用方法，這些方法對樣品的純度提出較高要求，并且所罕有的敷料不能對檢測過程形成擾亂，在經純化處理的樣品中體現出較好的適用性。而針對非目標蛋白含量較高的樣品或者輔料內含有添加蛋白的成品，則一定要使用特異性較強的方法檢測蛋白含量，比如免疫學檢測法、HPLC 法等。利用紫外吸收法檢測ADC 含量時，應全面分析單抗、連接子等對應的紫外吸收特性，進而從根本上保證蛋白質含量檢測結果的精確度。