膿毒癥患兒外周血單個核細胞中微小RNA-466和GPR18 mRNA的表達及診斷價值

趙 杰，董國慶

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)2015級兒科，廣東廣州 511436；2.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院兒科，廣東深圳 518033；3.廣東省深圳市婦幼保健院兒科，廣東深圳 518028)

膿毒癥是引起患兒死亡的常見疾病，其發(fā)展迅速，可引起休克等并發(fā)癥[1-4]，膿毒癥的診斷常依賴患兒臨床表現(xiàn)和白細胞(WBC)計數(shù)等檢查，但其診斷效能較低，不具有特異性，探索新的診斷標志物對提高膿毒癥診治水平具有重要意義。微小RNA(miRNA)廣泛存在于人體組織內(nèi)，可調(diào)控細胞生長及腫瘤進展等過程，被認為是炎癥和癌癥潛在的診斷分子標志物和治療靶標[5]。有研究顯示，在脂多糖誘導(dǎo)小鼠的支氣管肺泡中發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的miRNA-466表達增加[6]。G蛋白偶聯(lián)受體18(GPR18)由位于13q32.3上GPR基因編碼，是相對分子質(zhì)量約為36×103的蛋白，在大腸桿菌誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型循環(huán)中單核細胞和巨噬細胞中GPR18表達增加，且參與控制炎癥信號通路激活[7]。本研究檢測膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量，并探討其對膿毒癥患兒的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年10月至2019年6月在中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院(以下簡稱“本院”)兒科診斷和接受治療的膿毒癥患兒90例為病例組，其中男55例、女35例，年齡4個月至5歲、平均(2.19±0.71)歲。患兒入院時符合兒童膿毒癥診斷標準[8]，符合以下2項或2項以上指標時確診：(1)體溫>38 ℃或<36 ℃；(2)心率>90次/分鐘；(3)呼吸頻率>20次/分鐘或CO2分壓[Pa(CO2)]<32 mm Hg；(4)外周血WBC計數(shù)>12.0×109/L或<4.0×109/L，或未成熟粒細胞>10%。排除標準：(1)具有嚴重藥物過敏史者；(2)先天性免疫功能缺陷者；(3)治療配合不佳者。選取同期在本院兒科保健中心體檢的健康兒童60例為對照組，其中男35例、女25例，年齡3個月至5歲、平均(2.18±0.73)歲。兩組性別構(gòu)成、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準同意實施。

1.2方法

1.2.1序貫器官衰竭評分(SOFA評分) 膿毒癥患兒于確診后行全身性感染相關(guān)性SOFA評分[9]，包括呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、肝臟、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及腎臟共6個系統(tǒng)評估，每項評分為0～4分，總分為0～24分。分數(shù)越高，預(yù)后越差。

1.2.2WBC和C反應(yīng)蛋白(CRP)的檢測 采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集病例組于確診后12 h內(nèi)及對照組靜脈血各5 mL，儲存待測，送本院檢驗科行全血分析和CRP水平檢測。

1.2.3兩組外周血單個核細胞miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量的檢測 取待測抗凝血，采用密度梯度法分離單個核細胞，采用Trizol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取兩組血液標本總RNA，然后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)錄，以U6小核或β-actin為內(nèi)參，按熒光定量PCR試劑盒說明書在LightCycler 480熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀上行PCR。引物序列如下，miRNA-466引物：上游，5′-GCC CGT AAC AGT CTA CAG CCA T-3′；下游，5′-GCA GGG TCC GAG GTA TTC-3′。U6引物：上游，5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游，5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。GPR18引物：上游，5′-ACA TCC AAA ATC TTG ATC AGT TA-3′；下游，5′-AGG ACA GAC TTT CAA AAT G-TTT-3′。β-actin引物：上游，5′-AGC GAG CAT CC-CCC AAA GTT-3′；下游，5′-GGG CAC GAA G-GCT CAT CAT T-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)38次。算法采用2-ΔΔCt法，計算單個核細胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1兩組WBC、CRP、miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量的比較 病例組WBC和CRP水平均顯著高于對照組(P<0.05)；病例組外周血單個核細胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量均高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組WBC、CRP、miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量的比較

2.2WBC計數(shù)和CRP水平與SOFA評分的相關(guān)性 病例組WBC計數(shù)和SOFA評分無相關(guān)性(r=0.238，P=0.543)；膿毒癥患兒CRP水平和SOFA評分呈正相關(guān)(r=0.472，P<0.01)。

2.3miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量與SOFA評分的關(guān)系 膿毒癥患兒單個核細胞中miRNA-466相對表達量和SOFA評分呈正相關(guān)(r=0.489，P<0.001)；膿毒癥患兒外周血單個核細胞中GPR18 mRNA相對表達量和SOFA評分呈正相關(guān)(r=0.507，P<0.001)。

2.4miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量的關(guān)系 病例組單個核細胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量呈正相關(guān)(r=0.618，P<0.001)。

2.5相關(guān)指標對患兒膿毒癥的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，當CRP截斷值為131.52 μg/mL時，其診斷膿毒癥的曲線下面積(AUC)為0.758(95%CI：0.669～0.817)，靈敏度為68.0%，特異度為71.3%；當miRNA-466相對表達量截斷值為1.67時，其診斷膿毒癥的AUC為0.901(95%CI：0.813～0.969)，靈敏度為84.5%，特異度為87.9%；外周血單個核細胞中GPR18 mRNA相對表達量截斷值為1.89時，其診斷膿毒癥的AUC為0.858(95%CI：0.761～0.917)，靈敏度為71.0%，特異度為92.3%；當miRNA-466和GPR18mRNA聯(lián)合檢測時，其診斷膿毒癥的AUC為0.947(95%CI：0.898～0.981)，靈敏度為90.9%，特異度為93.9%。

3 討 論

膿毒癥是各種因素引起的全身炎性反應(yīng)，為兒科最常見的危重癥[10]。近年來，我國兒童膿毒癥發(fā)病率呈逐年升高趨勢，且臨床治愈率逐年提高[11]。盡管如此，鑒于兒童膿毒癥臨床表現(xiàn)多樣、病情發(fā)展迅速、病死率高的特點，急切需要對兒童膿毒癥進行早期、及時地診斷[12-13]。

盡管膿毒癥具體發(fā)病機制尚未完全清楚，但膿毒癥病情進展迅速，常導(dǎo)致全身多個器官功能障礙，甚至死亡，與機體炎性反應(yīng)及免疫功能紊亂密切相關(guān)[14]。因此，外周血中與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的非特異標志物，如WBC計數(shù)和CRP水平，常用于臨床診斷和評估膿毒癥患者的預(yù)后[15-16]，但其缺乏特異性，診斷效能不佳。miRNA是多種疾病診斷的標志物和潛在治療靶標[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA及其長鏈非編碼RNA參與調(diào)控炎性反應(yīng)及免疫過程，對膿毒癥診斷及預(yù)后具有重要價值[19-20]。

GPR18在人類白細胞中廣泛表達，尤其在單核細胞、中性粒細胞和巨噬細胞中表達水平較高，是參與巨噬細胞吞噬和自噬過程的重要分子標志物[7,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，病例組患兒外周血中WBC和CRP水平顯著高于對照組(P<0.05)。膿毒癥患兒機體處于炎癥激活狀態(tài)，導(dǎo)致與炎癥相關(guān)的非特異性蛋白CRP水平增加[22]。同時，本研究結(jié)果顯示，膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。ZHANG等[21]研究顯示，RT-PCR和流式細胞儀檢測菌血癥且在ICU接受治療的患者WBC中GPR18 mRNA 和蛋白表達均增加。盡管感染期間miRNA-466和GPR18 mRNA 增加的機制尚不清楚，但是其可能與機體在感染和應(yīng)激狀態(tài)下免疫系統(tǒng)激活、炎癥級聯(lián)反應(yīng)，以及巨噬細胞吞噬和自噬密切相關(guān)[23]。

Pearson相關(guān)分析顯示，WBC計數(shù)與SOFA評分無相關(guān)性，提示W(wǎng)BC計數(shù)可能受到多種因素影響，與膿毒癥患者病情嚴重程度缺乏關(guān)聯(lián)性，其原因可能為WBC計數(shù)雖為炎癥指標，但并不能反映膿毒癥的嚴重程度[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRP水平、外周血單個核細胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量均與患兒SOFA評分呈正相關(guān)(P<0.05)，同時miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量呈正相關(guān)(P<0.05)，說明CRP水平、外周血單個核細胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相對表達量可用于評估膿毒癥病情嚴重程度。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，CRP診斷膿毒癥患兒的AUC為0.758，外周血單個核細胞中miRNA-466相對表達量診斷膿毒癥的AUC為0.901，外周血單個核細胞中GPR18 mRNA相對表達量診斷膿毒癥的AUC為0.858，miRNA-466和GPR18 mRNA聯(lián)合檢測時，AUC為0.947，說明外周血中性粒細胞miRNA-466的診斷效能優(yōu)于GPR18 mRNA和CRP水平，并且聯(lián)合檢測miRNA-466及GPR18 mRNA時，AUC為0.947，其靈敏度和特異度可提高至90.9%和93.9%，因此，臨床上聯(lián)合檢測miRNA-466及GPR18 mRNA對膿毒癥診斷價值更高。

本研究為單中心研究，納入的病例數(shù)較少，尚需要大樣本多中心前瞻性研究來進一步證實；其次，本研究未探討在膿毒癥患兒治療過程中CRP、miRNA-466和GPR18mRNA表達變化情況；最后，膿毒癥患兒治療過程中不同的用藥和治療方法是否影響中性粒細胞miRNA-466和GPR18 mRNA表達尚需要進一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miRNA-466和GPR18 mRNA表達水平增加，且與患兒SOFA評分相關(guān)，聯(lián)合檢測miRNA-466及GPR18 mRNA對患兒膿毒癥具有較高的診斷價值。