非小細胞肺癌根治術后EGFR基因突變狀態對EGFR-TKI靶向治療效果的影響*

吳志美，喻海忠，桑玉玉

(江蘇省南通市中醫院檢驗科，江蘇南通 226001)

非小細胞肺癌屬原發性肺癌中最常見類型，據報道，近年來，其發病率呈逐年上升的趨勢，占肺癌的80%～85%，可能與吸煙、電離輻射等有關[1]。目前，根治性手術是治療早期非小細胞肺癌的標準治療方案，但有報道顯示，ⅠA～ⅡB期患者術后5年生存率僅為50%～80%，ⅢA期者僅為10%～30%[2]。已有研究證實腫瘤局部復發及遠處轉移是非小細胞肺癌根治性手術治療失敗與患者死亡的主要因素，而術后輔以化療，可預防癌癥轉移、復發，延長患者生存期[3]。但有報道指出，含鉑類的標準化化療方案僅對30%左右的非小細胞肺癌患者有效，且不良反應較多[4]。有研究顯示，表皮生長因子受體(EGFR)家族參與細胞增殖、凋亡、運動及新血管形成，是腫瘤形成的關鍵因素；而EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)已被臨床公認為是治療非小細胞肺癌有效的靶向藥物，尤其對EGFR基因突變型晚期非小細胞肺癌者，能取得良好的臨床療效，且普遍存在良好的依從性和耐受性[5]。但有報道指出，EGFR基因突變狀態是影響患者靶向治療效果的重要因素，其對非小細胞肺癌根治術后輔助化療效果的影響及EGFR-TKI靶向治療聯合化療影響的結論尚不一致[6]?；诖耍P者針對此方面展開相關研究，以供臨床參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2018年1月本院收治的80例非小細胞肺癌根治術后患者為研究對象。納入標準：(1)非小細胞肺癌臨床診斷參考《2010中國肺癌臨床指南》[7]，均經病理學、細胞學、組織學等檢查確診，且均已行單純根治性手術，入組前未接受除單純根治性手術外的任何抗腫瘤治療，預計生存期>6個月；(2)根據文獻[8]提到的病理TNM分期標準，患者TNM分期為ⅠB～ⅢA期；(3)年齡≥18歲，體能狀況(PS)評分≤2分；(4)首次接受術后輔助治療[化療和(或)靶向治療]，且均可耐受；(5)首次接受EGFR基因突變檢測，無相關禁忌證。排除標準：(1)心、腎、肺等重要臟器功能不全及精神疾?。?2)ⅢB期及Ⅳ期非小細胞肺癌；(3)合并其他惡性腫瘤；(4)伴肺心病、肺氣腫、慢性支氣管炎或其他嚴重疾病；(5)過敏體質或對本研究所涉及的藥物過敏；(6)妊娠或哺乳期女性。80例非小細胞肺癌根治術后患者中，EGFR野生型36例，EGFR突變型44例。按照EGFR基因突變檢測結果，將80例患者中36例EGFR野生型者納為A組；其余44例患者均為EGFR突變型，按照隨機數字表法分為B組(24例)和C組(20例)。3組均自術后第2周起接受順鉑+多西紫杉醇化療方案治療，以21 d為1個化療周期，持續4個周期；其中，C組于化療結束2周后行EGFR-TKI靶向治療。

1.2方法

1.2.1治療方法 (1)手術方案：根治性手術具體方法參考文獻[9]。(2)化療方案：所有患者均自術后第2周起接受順鉑+多西紫杉醇化療方案，以21 d為1個化療周期，持續4個化療周期。(3)EGFR-TKI靶向治療方案：單藥口服厄洛替尼。維持用藥4～8個月。注意治療期間，若有不可耐受的藥物不良反應出現時，予以停藥處理。

1.2.2EGFR基因突變檢測方法 (1)標本采集及DNA提取。入院后采集患者清晨空腹靜脈血3 mL，置入帶分離膠的黃色促凝管中，常溫下靜置4 h后室溫下3 000 r/min離心10 min，留取上層血清后置入Eppendorf管中，于-80 ℃保存備用。參考DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司，QIAamp Blood Mini Kit型)操作說明書，提取DNA。結束后，采用Nanodrop2000核酸定量儀(美國Thermo公司)，行DNA濃度及純度測定，光密度(A)值(A260 nm/A280 nm)維持1.8～2.0。純度要求滿足后行DNA質量凝膠電泳檢測，置入-20 ℃冰箱保存備用，保存時間<6個月。(2)EGFR基因突變檢測步驟。將陽性質控品及Tap酶(EGFR21)取出，先行陽性質控品解凍處理，后振蕩混勻，快速離心15 s待用。Tap酶(EGFR21)快速離心15 s備用。在45 μL陽性質控品及45 μL待測樣品DNA中均加入2.25 μL Tap酶(EGFR21)，在45 μL超純凈水中加入2.25 μL Tap酶(EGFR21)，渦旋器上混勻后快速離心15 s。于聚合酶鏈反應(PCR)管冰架上，將8聯PCR管反應條條蓋揭開。將混勻的DNA樣品依次取5 μL，沿PCR管的管壁加入8聯PCR管反應條中。采用突變特異性擴增系統法(ARMS)行PCR擴增，檢測EGFR基因外顯子18、19、20、21突變情況。待8聯PCR管反應條離心或輕甩處理后放入7300型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行擴增。具體擴增程序如下：第1階段，95 ℃ 5 min，1個循環；第2階段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個循環；第3階段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個循環；第4階段，60℃時進行FAM、HEX信號收集，執行實時PCR。(3)檢測結果判讀。確定樣品各反應管中突變Ct值及對應樣品外控Ct值。當樣品突變Ct值為陰性臨界值及以上時，判定此樣品為陰性或樣品濃度低于檢測試劑盒下限；當樣品突變Ct值低于陰性臨界值，且反應管突變Ct值低于陽性臨界值時，該樣品則屬突變陽性；當樣品突變Ct值低于陰性臨界值，且反應管突變Ct值為陽性臨界值及以上時，按照該反應管ΔCt(ΔCt=突變Ct-外控Ct)進行結果判定。若ΔCt低于對應ΔCt的Cut-off時，則屬突變陽性，反之則為陰性或低于檢測限值。

1.2.3血清腫瘤標志物的檢測 分別于治療前及治療6個月時，采集患者靜脈血3 mL，肝素抗凝，以2 500 r/min的速度離心10 min，取上層血清置于-20 ℃冰箱保存待測。采用i2000型化學發光免疫分析儀(美國雅培公司)，以電化學發光法檢測血清神經元特異性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)水平，試劑盒均購自美國雅培公司。

1.2.4不良反應的判斷 參照美國國立癌癥研究所制定的不良反應分級標準3.0版本[10]，分析骨髓抑制、神經毒性等不良反應發生情況。

1.3觀察指標 跟蹤觀察18個月，主要觀察指標包括治療前及治療6個月時血清腫瘤標志物水平、化療及靶向藥物不良反應和6、12、18個月無病生存率。

2 結 果

2.13組臨床資料比較 3組臨床資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組臨床資料比較

組別nTNM分期[n(%)]Ⅰ～ⅡⅢEGFR基因突變位置[n(%)]外顯子18外顯子19外顯子20外顯子21A組3627(75.00)9(25.00)----B組2418(75.00)6(25.00)2(8.33)12(50.00)1(4.17)9(37.50)C組2010(50.00)10(50.00)3(15.00)10(50.00)2(10.00)5(25.00)F/χ24.3641.507P0.1130.681

2.23組血清腫瘤標志物水平比較 3組治療前血清NSE、CEA、CA125水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；3組治療6個月時上述指標均顯著低于治療前(P<0.05)；A組治療6個月時上述指標均顯著高于B、C組(P<0.05)，B組治療6個月時上述指標均顯著高于C組(P<0.05)，見表2。

表2 3組血清腫瘤標志物水平比較

2.33組不良反應發生情況比較 3組不良反應發生率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。C組對EGFR-TKI靶向治療藥物耐受性均較好，僅4例(20.00%)發生Ⅰ度肝、腎損害，2例(10.00%)發生Ⅰ度胃腸道反應。

表3 不良反應發生情況比較[n(%)]

組別n肝、腎損害0度Ⅰ度Ⅱ度過敏反應0度Ⅰ度Ⅱ度A組3629(80.55)5(13.89)2(5.56)32(88.89)4(11.11)0(0.00)B組2420(83.33)2(8.33)2(8.33)20(83.33)4(16.67)0(0.00)C組2016(80.00)4(20.00)0(0.00)18(90.00)2(10.00)0(0.00)H1.4120.560P0.4960.757

2.43組無病生存率比較 A組6、12、18個月無病生存率分別為75.00%(27/36)、55.56%(20/36)、44.44%(16/36)，B組分別為100.00%(24/24)、83.33%(20/24)、75.00%(18/24)，C組分別為100.00%(20/20)、100.00%(20/20)、90.00%(18/20)。經Log-rank檢驗，3組6個月無病生存率比較，差異無統計學意義(χ2=0.221，P=0.637)。A組12個月無病生存率顯著低于C組，差異有統計學意義(χ2=4.485，P=0.030)；A、B組12個月無病生存率比較差異無統計學意義(χ2=2.109，P=0.145)，B、C組12個月無病生存率比較差異無統計學意義(χ2=1.284，P=0.258)。A組18個月無病生存率顯著低于B、C組，差異有統計學意義(χ2=4.462、6.105，P=0.035、0.013)；B、C組18個月無病生存率比較差異無統計學意義(χ2=1.260，P=0.262)。

3 討 論

非小細胞肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，早中期治療主要以根治性手術為主，但有報道顯示，其術后總復發和轉移率為30%～70%[11]。而目前多項研究表明，針對高危ⅠB～ⅢA期根治性手術后的非小細胞肺癌患者，行含鉑類兩藥化療方案常規治療4個周期，可明顯提高5年生存率[12-13]。非小細胞肺癌根治術后行含鉑類兩藥化療方案能有效清除微小轉移灶及微小殘存灶，并將外周血循環腫瘤細胞清除，促使局部復發及遠處轉移減少，改善患者遠期生存狀況。但目前關于EGFR突變型患者與EGFR野生型患者對化療療效的差異性仍存在爭議[14-15]。

本研究結果顯示，3組治療6個月時血清NSE、CEA、CA125水平均明顯低于治療前；而A組治療6個月時上述指標均明顯高于B、C組，B組治療6個月時上述指標均明顯高于C組(P<0.05)，提示非小細胞肺癌根治術后EGFR基因突變狀態對EGFR-TKI靶向治療及化療療效有明顯影響。以往報道顯示，CEA、CA125等腫瘤標志物在非小細胞肺癌等惡性腫瘤患者中會出現一定程度的升高[16]。且EGFR突變型非小細胞肺癌患者化療后血清NSE、CEA、CA125水平較野生型患者低[17-18]。筆者認為，順鉑+多西紫杉醇化療方案可有效減少腫瘤負荷，降低腫瘤惡性程度，促使血清NSE、CEA、CA125水平下降，但EGFR野生型和EGFR突變型患者血清腫瘤標志物水平差異有統計學意義(P<0.05)，可能與其抑制原癌基因過度表達、增加抑癌基因表達量等有關。而EGFR-TKI靶向治療能進一步清除惡性腫瘤細胞內DNA合成，加快機體對惡性腫瘤細胞的清除，使血清腫瘤標志物水平降低。

本研究結果顯示，3組6個月無病生存率差異無統計學意義(P>0.05)，且A組18個月無病生存率顯著低于B組，差異有統計學意義(P<0.05)，說明非小細胞肺癌根治術后EGFR基因突變狀態影響術后輔助化療療效。分析原因，有絲分裂原活化蛋白激酶途徑屬細胞增殖、分化、凋亡調節的信號傳導通路，鉑類藥物可通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶通路，促使細胞凋亡；而EGFR基因突變易誘發EGFR過表達，亦通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶通路，促使腫瘤細胞對化療的敏感性增加，但具體機制尚不明確。此外，本研究結果顯示，A組12、18個月無病生存率明顯低于C組，證實術后采用EGFR-TKI靶向治療聯合化療的EGFR突變型患者無病生存率明顯優于術后單純化療的EGFR野生型者。有報道通過對167例ⅠB～ⅢA期行肺腺癌根治術的患者進行系統研究，發現含鉑類化療聯合EGFR-TKI靶向治療的EGFR基因突變型患者2年無病生存率達87.4%，明顯優于術后單純化療的EGFR野生型者(71.2%)，與本研究結果相似[19]。原因可能為EGFR-TKI靶向治療能進一步抑制根治性手術后的殘存病灶、微轉移灶與外周血循環中腫瘤細胞，但具體機制有待今后深入研究。筆者認為，EGFR靶向治療經特定分子靶向藥物識別及攻擊腫瘤細胞特定分子靶點，可控制腫瘤發展、侵襲、轉移，改善患者生存情況。此外，本研究中B組與C組12、18個月無病生存率差異無統計學意義(P>0.05)，可能與觀察時間較短、選取病例數偏少有關。

另外，本研究發現，3組化療不良反應發生率差異無統計學意義(P>0.05)，說明3組化療的不良反應均較輕。而本研究中，C組接受EGFR-TKI靶向治療，僅4例發生肝、腎損害，2例發生Ⅰ度胃腸道反應，預示患者耐受性良好，證實EGFR-TKI靶向治療安全性較高。筆者認為，術后輔助化療聯合EGFR-TKI靶向治療，不良反應較輕，無嚴重后遺癥，患者耐受性較好。

4 結 論

綜上所述，非小細胞肺癌根治術后EGFR基因突變狀態對EGFR-TKI靶向治療效果具有重要影響，臨床應引起足夠重視。但本文因樣本量偏小，觀察時間受限，結果可能存在偏倚，故今后需深入探討。