改良支原體培養(yǎng)鑒定方法的探索*

蔡高臺(tái)，程燦燦，張洪榮，李榕嬌，周彩容，陳憲楷，尹小毛

(1.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510900；2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 515400;3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528315)

支原體是常見(jiàn)的泌尿生殖道病原體，主要包括解脲脲原體(Uu)、微小脲原體(Up)、人型支原體(Mh)和生殖支原體(Mg)等，可引起成人和嬰兒的多種感染[1]。除了Mg外，其他支原體的實(shí)驗(yàn)室診斷主要通過(guò)培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)[2]。目前，有許多商業(yè)診斷試劑盒用于支原體的培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)，其中支原體IST2試劑盒被廣泛用于Mh和脲原體(本文將Uu和Up統(tǒng)稱(chēng)為脲原體)的檢測(cè)。采用IST2試劑盒對(duì)黏液標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，包裹在黏液中的支原體很難被釋放，將導(dǎo)致支原體在液體培養(yǎng)基中分布不均，使后續(xù)的菌落計(jì)數(shù)和藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。本研究將通過(guò)延長(zhǎng)標(biāo)本洗脫后放置時(shí)間來(lái)解決這一問(wèn)題。具體內(nèi)容如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年11—12月在婦科門(mén)診就診或住院的患者陰道分泌物標(biāo)本32份，均為帶有濃稠黏液或透明黏液的標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 FAST 96-WELL型PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad公司。Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker 1000均購(gòu)自TaKaRa公司，DNA提取液購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，支原體培養(yǎng)、鑒定、藥物敏感性一體化試劑盒購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。引物合成及測(cè)序服務(wù)均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)及分組 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)本的接種及結(jié)果判斷。對(duì)照組：支原體培養(yǎng)基溶解后，將陰道分泌物拭子在培養(yǎng)基中進(jìn)行洗脫，然后取培養(yǎng)液加入檢測(cè)試條的反應(yīng)孔中(每孔50 μL)，用液體石蠟封閉后直接放入溫箱中孵育，剩余液體培養(yǎng)物也放入溫箱中孵育。試驗(yàn)組：4 h后取出剩余液體培養(yǎng)物并再次混勻，然后取一張新的檢測(cè)試條，將培養(yǎng)液加入檢測(cè)試條的反應(yīng)孔中(每孔50 μL)，后續(xù)試驗(yàn)步驟同對(duì)照組。觀察記錄兩組檢測(cè)試條在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的藥物敏感性及菌落數(shù)差異。

1.3.2脲原體DNA提取 對(duì)于藥物敏感性有差異的菌株，取其液體培養(yǎng)物上清液400 μL，12 000 r/min離心5 min后棄上清液，加滅菌生理鹽水1 mL，充分混勻后12 000 r/min離心5 min并棄上清液；沉淀中加入50 μL DNA提取液，充分混勻后100 ℃溫浴10 min，冷卻后12 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.3.3PCR擴(kuò)增及測(cè)序 以提取的脲原體DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增相關(guān)耐藥基因并進(jìn)行測(cè)序分析。所涉及的引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，退火30 s(各片段溫度參考表1)，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物列表

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 參照已報(bào)道的支原體標(biāo)準(zhǔn)株Up ATCC 700970(GenBank序列號(hào)：AF222894)和Uu ATCC 33699(GenBank序列號(hào)：CP001184)的gyrA、gyrB、parC、parE,23S rRNA基因、L22、L4蛋白基因，分析耐藥菌株的各基因序列的突變情況并進(jìn)行氨基酸預(yù)測(cè)，tetM基因分析為檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否有擴(kuò)增目標(biāo)條帶。分析有藥物敏感性改變的菌株是否有耐藥基因突變。

2 結(jié) 果

2.1菌落數(shù)差異 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)入組標(biāo)準(zhǔn)，符合條件的標(biāo)本共32份，其中出現(xiàn)菌落數(shù)差異16份，存在藥物敏感性差異12份，其中3份標(biāo)本同時(shí)出現(xiàn)菌落數(shù)差異及藥物敏感性差異。見(jiàn)表2。

表2 兩組中菌落數(shù)差異情況

2.2藥物敏感性差異 在兩組藥物敏感性比較中，出現(xiàn)差異的有12份，具體差異情況見(jiàn)表3。

表3 兩組中12份標(biāo)本對(duì)不同藥物的敏感性差異

2.3相關(guān)耐藥基因檢測(cè)及突變情況 在出現(xiàn)藥物敏感性差異的菌株中，選擇8株菌進(jìn)行了相關(guān)耐藥基因檢測(cè)。其中1號(hào)菌只檢測(cè)tetM基因，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在該基因。其余7株菌的檢測(cè)情況見(jiàn)表4。

表4 耐藥相關(guān)基因在藥物敏感性差異菌株中的突變情況

3 討 論

脲原體和Mh是泌尿生殖道最常見(jiàn)的兩種病原體，其感染可導(dǎo)致女性宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎等，男性尿道炎、慢性前列腺炎、附睪炎等。據(jù)報(bào)道支原體的感染以單純的脲原體感染較多[5]，感染人群以女性為主[6-7]。支原體“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測(cè)方法為液體培養(yǎng)與固體培養(yǎng)相結(jié)合的方法[8]，但由于該方法耗時(shí)長(zhǎng)、步驟多而較難滿(mǎn)足臨床需求。目前臨床較常用的檢測(cè)方法是液體培養(yǎng)鑒定加藥物敏感性試驗(yàn)，但是該方法常常因黏液影響而檢測(cè)不準(zhǔn)確，改進(jìn)培養(yǎng)方法有助于提高支原體培養(yǎng)的陽(yáng)性率和藥物敏感性試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

在本研究中，試驗(yàn)組與對(duì)照組存在菌落數(shù)差異比例達(dá)到50%(16/32)，試驗(yàn)方法明顯提高了支原體的檢出率。在相應(yīng)的藥敏試驗(yàn)中也出現(xiàn)了差異，有11株出現(xiàn)了耐藥等級(jí)的升高，而僅有1株是耐藥等級(jí)的降低，這也說(shuō)明可能較濃稠的黏液在液體培養(yǎng)基中分配不均，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。

本研究對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果有差異的菌株進(jìn)行了耐藥基因檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)了耐藥突變位點(diǎn)。23S rRNA基因及核糖體蛋白L22及L4基因的突變，是目前造成大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥的主要原因[9]。本研究中L22蛋白的基因突變位點(diǎn)較多，其中G361T(A121S)和C422T(T141I)是兩個(gè)較典型的突變多態(tài)性位點(diǎn)，也有研究報(bào)道G196A(D66N)為突變多態(tài)性位點(diǎn)[10]。通常認(rèn)為這種氨基酸多態(tài)性與耐藥無(wú)關(guān)。但A406G(I136V)位點(diǎn)并未見(jiàn)報(bào)道過(guò)，是否與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥相關(guān)也無(wú)臨床及實(shí)驗(yàn)證據(jù)，尚需進(jìn)一步研究。

旋轉(zhuǎn)酶是由gyrA和gyrB基因編碼，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ由parC和parE基因編碼。研究顯示，4個(gè)基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)域(QRDRs)突變與支原體對(duì)該類(lèi)藥物的耐藥有關(guān)[11]。本研究檢測(cè)了4株脲原體上述4個(gè)基因中的QRDRs突變情況。其中parC基因的 C248T(S83L)突變，可能與左氧氟沙星的耐藥有關(guān)[12]。另外C398T位點(diǎn)突變?cè)斐?33位氨基酸由P變成L，該位點(diǎn)暫未發(fā)現(xiàn)有報(bào)道與喹諾酮類(lèi)相關(guān)。脲原體耐藥機(jī)制復(fù)雜，除QRDRs基因突變外，還有其他相關(guān)耐藥機(jī)制如形成生物被膜等[13]。因此，其余菌株未檢測(cè)到喹諾酮相關(guān)突變耐藥基因也可能對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥。

支原體對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物耐藥與tetM基因攜帶及表達(dá)相關(guān)[14]。本研究檢測(cè)的1號(hào)菌株攜帶tetM基因，這極有可能是其對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物不敏感的原因。據(jù)報(bào)道，攜帶tetM蛋白的Mh表現(xiàn)為對(duì)四環(huán)素的不同程度的耐藥，而對(duì)多西環(huán)素則可以表現(xiàn)為敏感[15]。關(guān)于脲原體的研究則表明，tetM蛋白使其對(duì)耐四環(huán)素類(lèi)藥物的貢獻(xiàn)并不確定[3]。在大多數(shù)的脲原體調(diào)查研究中，其對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物相對(duì)較敏感，tetM基因的檢出并不多見(jiàn)。但tetM基因通常位于脲原體的染色體可轉(zhuǎn)移性元件上，快速傳播的風(fēng)險(xiǎn)比較高，因此更應(yīng)受到重視。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)支原體鑒定藥敏試劑盒的培養(yǎng)方法作了部分修改，以便培養(yǎng)帶有黏液的標(biāo)本時(shí)得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)支原體的陽(yáng)性率有所提高，藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)生了變化，但其結(jié)果的變化是否準(zhǔn)確反映菌種耐藥分子特征尚不能確定。對(duì)耐藥基因的檢測(cè)則發(fā)現(xiàn)parC基因的 C398T(P133L)和L22基因的A406G (I136V)兩個(gè)突變，其耐藥相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。