微柱凝膠法檢測(cè)血液中兩種抗菌藥物誘導(dǎo)形成藥物性抗體的研究*

董 林，包 進(jìn)，趙昕亞，徐 菲

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院輸血科，江蘇南京 210006)

藥物誘導(dǎo)的免疫性溶血性貧血(DIIHA)是一種由IgG或者IgM介導(dǎo)細(xì)胞毒性抗體的Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)[1]，主要的發(fā)病機(jī)制是產(chǎn)生相應(yīng)的抗藥物抗體，隨著藥物再次使用可能導(dǎo)致溶血的發(fā)生，患者使用抗菌藥物后發(fā)生此種不良反應(yīng)較多[2]。目前，有關(guān)藥物性抗體的研究報(bào)道較少，且檢驗(yàn)科和輸血科未開(kāi)展對(duì)藥物性抗體的檢測(cè)，因此，患者發(fā)生溶血后，分析溶血發(fā)生的原因具有重要的意義。頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉和哌拉西林鈉舒巴坦鈉是臨床上較為常用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合抗菌藥物，為了解藥物性抗體形成的可能性，本文收集188例在本院住院期間使用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉和哌拉西林鈉舒巴坦鈉治療的患者血液標(biāo)本，應(yīng)用藥物包被紅細(xì)胞的方法，通過(guò)微柱凝膠抗人球蛋白檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)藥物性抗體存在的可能性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2019年4-9月收治的采用注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉和哌拉西林鈉舒巴坦鈉藥物治療的患者188例為研究對(duì)象，其中男102例，女86例；年齡34～83歲，平均(65.41±10.28)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：使用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉和哌拉西林鈉舒巴坦鈉治療3 d以上；使用藥物后標(biāo)本中血紅蛋白水平低于使用藥物之前；使用藥物之前不規(guī)則抗體、直接抗人球蛋白試驗(yàn)(DAT)、藥物性抗體均為陰性；住院前均未接受抗菌藥物的治療。188例患者中使用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉治療112例，使用哌拉西林鈉舒巴坦鈉治療76例。

1.2儀器與試劑

1.2.1試劑 微柱凝膠抗人球蛋白檢測(cè)卡、不規(guī)則抗體篩檢細(xì)胞(人紅細(xì)胞，長(zhǎng)春博迅生物生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉(輝瑞制藥有限公司)；注射用哌拉西林鈉舒巴坦鈉(湘北威爾曼制藥股份有限公司)；頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抗體陰性和陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)試劑、哌拉西林鈉舒巴坦鈉抗體陰性和陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)試劑(江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰生物醫(yī)藥有限公司)；O型紅細(xì)胞(南京市血液中心健康獻(xiàn)血者血源)；0.9%氯化鈉注射液(安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)；巴比妥緩沖液、磷酸鹽(PBS)緩沖液(南京信帆生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2儀器 標(biāo)本離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械公司)；微柱凝膠卡專(zhuān)用離心機(jī)、孵育器(長(zhǎng)春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司)。

1.3方法 采集所有研究對(duì)象的空腹靜脈血3 mL，使用EDTA-K2抗凝。

1.3.1DAT 濃縮紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉溶液稀釋成濃度為0.8%的紅細(xì)胞懸液，取50 μL加入含有抗球蛋白試劑的微柱凝膠卡中，采用專(zhuān)用離心機(jī)離心后判斷DAT結(jié)果，對(duì)DAT陰性的標(biāo)本進(jìn)行血漿中藥物性抗體的檢測(cè)，對(duì)DAT陽(yáng)性的標(biāo)本檢測(cè)血漿和放散液中的藥物性抗體。

1.3.2不規(guī)則抗體篩查 通過(guò)間接抗球蛋白試驗(yàn)(IAT)檢測(cè)不規(guī)則抗體：將50 μL血漿標(biāo)本和50 μL不規(guī)則抗體篩檢細(xì)胞加入微柱凝膠抗球蛋白檢測(cè)卡中，37 ℃孵育15 min，900 r/min離心2 min，1 500 r/min離心3 min，讀取結(jié)果。

1.3.3放散試驗(yàn) 收集所有DAT陽(yáng)性患者的標(biāo)本，吸取100 μL濃縮紅細(xì)胞，采用生理鹽水洗滌3次，加入等體積的生理鹽水，放入56 ℃震蕩水浴箱10 min，迅速離心分離放散液。

1.3.4兩種舒巴坦類(lèi)抗菌藥物包被紅細(xì)胞的制備 將藥物0.1 g溶于0.25 mL pH為9.6～9.8的巴比妥緩沖液中，同時(shí)加入洗滌后的O型紅細(xì)胞170 μL；另取試管加入同樣的洗滌后O型紅細(xì)胞和巴比妥緩沖液。室溫孵育1 h，其間反復(fù)混勻數(shù)次，之后用PBS緩沖液洗滌紅細(xì)胞3次，并配置成5%的溶液，4 ℃冰箱保存1周。使用前用生理鹽水洗滌PBS緩沖液中的O型紅細(xì)胞后，并用生理鹽水稀釋成細(xì)胞濃度為2%。

1.3.5藥物包被紅細(xì)胞檢測(cè) 抗體檢測(cè)試劑盒陰性、陽(yáng)性對(duì)照試劑各50 μL與2%的紅細(xì)胞(藥物包被和無(wú)藥物包被)25 μL混合后加入微柱凝膠卡，37 ℃孵育60 min，900 r/min離心2 min，1 500 r/min離心3 min。用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抗體以及哌拉西林鈉舒巴坦鈉抗體陰性和陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)試劑對(duì)藥物包被的紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，從而判斷包被成功與否。

1.3.6藥物性抗體檢測(cè) 用生理鹽水洗滌藥物包被后的紅細(xì)胞，并稀釋成濃度為2%的溶液。取微柱凝膠抗人球蛋白卡，從左到右標(biāo)記4個(gè)孔，孔中加入相應(yīng)的血漿/放散液和藥物包被紅細(xì)胞，見(jiàn)表1。37 ℃孵育60 min、900 r/min離心2 min、1 500 r/min離心3 min，判斷結(jié)果。僅有第1孔加入患者血漿/放散液和藥物包被O型紅細(xì)胞中出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，為藥物性抗體陽(yáng)性。

表1 藥物性抗體檢測(cè)的微柱凝膠卡孔中所加入的血漿和紅細(xì)胞

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不規(guī)則抗體篩查 188例血漿標(biāo)本不規(guī)則抗體篩查結(jié)果均為陰性。

2.2DAT檢測(cè) 188例標(biāo)本中DAT陽(yáng)性有36例，其中頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉藥物使用者23例陽(yáng)性，哌拉西林鈉舒巴坦鈉藥物使用者13例陽(yáng)性。

2.3藥物包被紅細(xì)胞檢測(cè) 僅有第3孔加入陽(yáng)性對(duì)照和藥物包被紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，為陽(yáng)性，表示藥物包被紅細(xì)胞成功。其余3孔均無(wú)凝集現(xiàn)象，為陰性。見(jiàn)表2。

表2 藥物包被紅細(xì)胞的結(jié)果

2.4兩種藥物性抗體陽(yáng)性率的比較 頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉藥物性抗體的陽(yáng)性率(31.245%)高于哌拉西林鈉舒巴坦鈉藥物性抗體的陽(yáng)性率(18.42%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而DAT陽(yáng)性的標(biāo)本中，頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉藥物性抗體陽(yáng)性率(47.82%)略高于哌拉西林鈉舒巴坦鈉藥物性抗體的陽(yáng)性率(46.15%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DAT陰性標(biāo)本中，頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉藥物性抗體的陽(yáng)性率(26.97%)高于哌拉西林鈉舒巴坦鈉藥物性抗體的陽(yáng)性率(12.70%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩種藥物性抗體的陽(yáng)性率對(duì)比

2.5DAT陽(yáng)性放散液中不規(guī)則抗體、藥物性抗體檢測(cè) 36例DAT陽(yáng)性標(biāo)本的放散液中不規(guī)則抗體檢查結(jié)果均為陰性，11例頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉藥物性抗體陽(yáng)性的放散液中藥物性抗體檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性，6例哌拉西林鈉舒巴坦鈉藥物抗體陽(yáng)性的放散液中藥物性抗體檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性。

3 討 論

DIIHA是一種較為少見(jiàn)的藥物不良反應(yīng)[3]，它與藥物活性無(wú)關(guān)，主要是由于長(zhǎng)時(shí)間或者與大量的藥物接觸造成的[1]。頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物是臨床應(yīng)用較為廣泛的藥物之一，約有80%會(huì)導(dǎo)致藥物性溶血性貧血[4]，其中最為明顯的是第2代或者第3代頭孢菌素[5]。頭孢哌酮是第3代頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物，通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成發(fā)揮抗菌作用，一直以來(lái)被廣泛應(yīng)用于臨床，其對(duì)造血系統(tǒng)的毒性較為明確，主要表現(xiàn)為血小板減少和凝血功能障礙，貧血的報(bào)道較為少見(jiàn)[6-7]。王晴[8]認(rèn)為第3代頭孢菌素造成血紅蛋白減少的原因?yàn)槠淇赡芤鸸撬柙煅δ芡R春婭等[9]研究發(fā)現(xiàn)患者使用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉后，出現(xiàn)血紅蛋白下降、血小板降低、DAT陽(yáng)性、溶血指標(biāo)上升等情況，認(rèn)為其血漿中存在頭孢菌素類(lèi)藥物的抗體。TASCH等[10]研究指出，頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物引起藥物性溶血主要是體內(nèi)存在藥物抗體。哌拉西林鈉舒巴坦鈉是一種青霉素和酶抑制劑的復(fù)合制劑，對(duì)各種細(xì)菌都有較好的抗菌活性，廣泛用于重癥感染患者的治療。LEGER等[11]研究發(fā)現(xiàn)，73例DIIHA患者中有13例使用了哌拉西林，這13例患者均出現(xiàn)了急性溶血反應(yīng)，DAT結(jié)果也為陽(yáng)性。LOHIYA等[12]認(rèn)為哌拉西林誘導(dǎo)貧血的機(jī)制可能是由于抗體/半抗原與紅細(xì)胞膜表面蛋白共價(jià)結(jié)合后形成半抗原/蛋白復(fù)合物，從而導(dǎo)致體內(nèi)抗體的產(chǎn)生，破壞紅細(xì)胞從而超過(guò)骨髓的代償能力。LEGER等[11]報(bào)道，美國(guó)近50%使用哌拉西林的隨機(jī)住院患者體內(nèi)可產(chǎn)生哌拉西林藥物性抗體，陽(yáng)子驥等[13]也報(bào)道哌拉西林比較容易產(chǎn)生相應(yīng)的藥物性抗體。

微柱凝膠抗人球蛋白檢測(cè)技術(shù)是將間接抗人球蛋白技術(shù)和凝膠的分子篩作用結(jié)合的一種血清學(xué)分析技術(shù)，當(dāng)血清中有IgG或IgM類(lèi)藥物性抗體存在，可以與相應(yīng)的藥物包被紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，在凝膠中抗人IgG抗體的橋連作用下，形成紅細(xì)胞的凝塊，離心后并不能通過(guò)凝膠從而沉積在凝膠上端，未凝集的紅細(xì)胞沉積到凝膠底部[14]，從而可以反映藥物性抗體的存在。目前輸血科通常運(yùn)用該技術(shù)檢測(cè)與血型系統(tǒng)相關(guān)的意外抗體。本研究中所有血漿標(biāo)本及DAT陽(yáng)性標(biāo)本的放散液中不規(guī)則抗體均為陰性，因此，排除檢測(cè)過(guò)程中由于血型相關(guān)意外抗體陽(yáng)性導(dǎo)致假陽(yáng)性的可能。一直以來(lái)DAT陽(yáng)性的標(biāo)本被認(rèn)為和藥物性抗體有著較為密切的關(guān)系[15]，本研究發(fā)現(xiàn)，DAT陽(yáng)性標(biāo)本中，頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉和哌拉西林鈉舒巴坦鈉的藥物性抗體在血漿和放散液中均有存在；而對(duì)于DAT陰性的標(biāo)本，也發(fā)現(xiàn)兩種藥物相應(yīng)的藥物性抗體，可能原因如下：一是DAT結(jié)果陽(yáng)性可能并不是藥物性抗體導(dǎo)致的；二是由于在既往報(bào)道中患者均出現(xiàn)了部分臨床癥狀，此時(shí)患者已使用抗菌藥物進(jìn)行治療，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞表面吸附較多的藥物性抗體，引起DAT結(jié)果陽(yáng)性。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉藥物性抗體以及DAT陰性標(biāo)本中頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉藥物性抗體陽(yáng)性率均高于哌拉西林鈉舒巴坦鈉藥物性抗體的陽(yáng)性率，說(shuō)明頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉藥物性抗體形成的可能性較大；而在DAT陽(yáng)性標(biāo)本中，兩者的陽(yáng)性率相似，均在50%左右，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。筆者認(rèn)為當(dāng)DAT出現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)，患者已經(jīng)出現(xiàn)臨床癥狀，或者輸血科配血過(guò)程中已經(jīng)出現(xiàn)無(wú)法相合的情況，此時(shí)藥物性抗體的產(chǎn)生可能與所用的藥物并無(wú)關(guān)系。

4 結(jié) 論

綜上所述，臨床使用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉和哌拉西林鈉舒巴坦鈉過(guò)程中，無(wú)論DAT結(jié)果是否為陽(yáng)性，都可能產(chǎn)生相應(yīng)的藥物性抗體；而頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抗體形成的可能性高于哌拉西林鈉舒巴坦鈉。