武漢地區育齡期漢族女性葉酸代謝相關酶基因多態性研究*

李 卉，江雨霏，高唐鑫子，劉麗君，姚妍怡，易美琪，徐閏紅，宋婕萍

(湖北省婦幼保健院檢驗科，湖北武漢 430070)

葉酸作為體內一碳代謝的重要物質，參與DNA、RNA的合成轉化等機體內多種重要生化過程，是細胞生長和增殖的必需物質[1]。維持體內適當的葉酸水平對生殖健康有著重要的生理作用。孕婦體內葉酸缺乏是新生兒神經管缺陷(NTDs)發生的主要病因，孕期女性補充葉酸可有效預防出生缺陷的發生[2-4]。然而，近年來研究表明，過量攝入葉酸并不安全，尤其是在某些特定年齡或種族人群中[5]。

葉酸缺乏除受飲食攝入不足影響外，也與個體遺傳因素密切相關。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸代謝的關鍵酶，其基因突變可導致相應的酶活性和熱穩定性降低，引起葉酸代謝障礙。遺傳異質性導致了機體對葉酸利用能力的差異，葉酸增補應因人而異。本研究通過基因檢測，對本地區育齡期漢族女性MTHFR和MTRR基因多態性進行個體化評估分析，為育齡期女性制訂個性化的孕期葉酸補充方案提供遺傳學和臨床循證依據，為出生缺陷的個體化防控提供指導。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年5月至2020年1月在湖北省婦幼保健院進行孕前和孕期檢查的育齡期漢族女性4 216例為研究對象。年齡17～48歲，平均(29.1±4.1)歲。經知情同意后采集外周血進行葉酸利用能力評估。

1.2儀器與試劑 核酸提取試劑(廈門致善Lab-Aid 824核酸提取Mini試劑)，葉酸基因多態性檢測試劑購自武漢友芝友公司。PCR擴增儀為上海宏石SLAN-96S。

1.3方法 提取樣本基因組DNA。利用PCR-熒光探針法，檢測MTHFR基因C677T、A1298C位點與MTRR基因A66G位點的基因多態性。通過計算Ct值判定MTHFR和MTRR基因各位點多態性。

1.4統計學處理 應用HaploView 4.2軟件進行單核苷酸多態性的Hardy-Weinberg平衡分析、LD連鎖不平衡分析。采用SPSS19.0軟件對數據進行統計分析。計數資料采用百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡分析 對本研究中4 216例育齡期女性MTHFR基因C677T、A1298C位點和MTRR基因A66G位點檢測結果進行Hardy-Weinberg遺傳平衡分析，其基因多態性分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，說明數據來自同一孟德爾群體，樣本具備區域代表性，見表1。

表1 武漢地區育齡期漢族女性MTHFR及MTRR基因位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.2MTHFR和MTRR的基因頻數與等位基因頻率 4 216例標本中，MTHFR基因C677T位點的野生型(CC)、雜合突變(CT)與純合突變(TT)頻數分別為1 595例(37.8%)、1 953例(46.3%)、668例(15.8%)，C677T位點突變堿基T的攜帶頻率為39.0%；A1298C位點野生型(AA)、雜合型突變(AC)、純合突變(CC)頻數分別為2 836例(67.3%)、1 230例(29.2%)、150例(3.6%)，突變堿基C攜帶頻率為18.1%。MTRR基因A66G野生型(AA)、雜合突變(AG)、純合突變(GG)的頻數分別為2 384例(56.5%)、1 581例(37.5%)、251例(6.0%)，突變堿基G攜帶頻率為24.7%。

2.3MTHFR、MTRR基因頻數和基因頻率與其他地區的比較 武漢地區育齡期漢族女性MTHFR C677T位點基因型分布與尚志[6]、長春[7]、張家口[8]、太原[9]、煙臺[10]、鄭州[11]、湘潭[12]、柳州[13]、陽江[14]、瓊海[15]地區漢族女性差異有統計學意義(P<0.05)，與建始[16]、眉山[17]、麗水[18]、六盤水[19]地區的差異無統計學意義(P>0.05)。武漢地區育齡期漢族女性MTHFR A1298C位點基因多態性分布與尚志、張家口、太原、煙臺、鄭州、湘潭、柳州、陽江、瓊海地區的差異有統計學意義(P<0.05)。 MTRR A66G基因多態性分布與張家口、太原、煙臺、柳州、陽江、瓊海地區的差異有統計學意義(P<0.05)。見表2～4。

表2 不同地區漢族女性MTHFR C677T基因型頻數和頻率比較[n(%)]

表3 不同地區漢族女性MTHFR A1298C基因型頻數和頻率比較[n(%)]

表4 不同地區漢族女性MTRR A66G基因型頻數和頻率比較[n(%)]

2.4MTHFR、MTRR等位基因頻數和頻率與其他地區的比較 武漢地區漢族育齡期女性MTHFR C677T與A1298C等位基因分布與尚志、長春、煙臺、鄭州、湘潭、柳州、陽江、瓊海地區差異有統計學意義(P<0.05)； MTRR A66G等位基因分布與太原、煙臺、柳州、陽江、瓊海地區差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 不同地區漢族女性MTHFR和MTRR等位基因頻數和頻率比較[n(%)]

2.5MTHFR基因C677T和A1298C兩位點連鎖情況及單倍型分析 MTHFR基因C677T和A1298C兩位點組合情況依次為CC/AA(18.95%)、CT/AA(32.57%)、TT/AA(15.75%)、CC/AC(15.39%)、CT/AC(13.71%)、CC/CC(3.49%)、TT/AC(0.07%)、CT/CC(0.05%)、TT/CC(0.02%)。單倍型分析表明4種組合頻率依次為677C/1298A(43.0%)、677T/1298A(38.9%)、677C/1298C(18.0%)、677T/1298C(0.1%)，以677C/1298A為主。兩位點間存在高度連鎖不平衡現象(D′=0.980，r2=0.136)。

2.6武漢地區育齡期女性葉酸利用能力風險評估 武漢地區育齡期女性葉酸利用能力正常，以及低、中、高度風險人群分別占37.7%、7.8%、35.2%和19.4%。可見有超過50.0%的育齡期女性存在不同程度的葉酸利用能力不足，對于這部分人群，常規0.4 mg/d葉酸補充并不能滿足孕前或孕早期機體對于葉酸的需要。

3 討 論

葉酸是人體必不可少的營養素，在體內以具有活性的四氫葉酸形式發揮作用，作為體內一碳循環的載體，參與核酸合成、蛋白質甲基化，并與維生素B12共同促進紅細胞的生成和成熟，是細胞增殖、組織生長和修復、機體發育過程中不可或缺的重要物質。葉酸代謝過程受兩個關鍵酶的基因調控，分別是MTHFR和MTRR。MTHFR基因位于染色體1p36.3，有12個外顯子，編碼蛋白質含657個氨基酸。常見的MTHFR基因多態性有C677T(rs1801133)和A1298C(rs1801131)。這兩處位點的突變間存在協同作用，引起MTHFR酶活性降低，當雙突變時酶活性僅為野生型的15%左右；MTRR基因位于染色體5p15.2～5p15.3，其多態性位點A66G(rs1801394)是神經管缺陷發生的獨立風險因素，與胎兒先天性心臟病風險增加相關[20]。MTHFR與MTRR基因發生變異引起相應的酶活性降低，抑制同型半胱氨酸轉化，導致低葉酸血癥和高同型半胱氨酸血癥，從而增加不孕不育、流產死胎、胎兒先天缺陷等發生風險[21]。孕婦體內缺乏葉酸可能導致新生兒出生缺陷與不良妊娠結局，如神經管缺陷、唐氏綜合征、先天性心臟病、唇腭裂、妊娠期高血壓、子癇前期、胚胎停育、流產、早產等，葉酸代謝基因多態性還與多囊卵巢綜合征、宮頸癌、卵巢癌、女性特殊時期抑郁癥等有關[22-24]。

本研究結果顯示，武漢地區育齡期漢族女性MTHFR C677T 純合突變(TT型)頻率為16.0%，與既往報道類似[25]；顯著低于北方城市尚志[6]、長春[7]、張家口[8]、太原[9]、煙臺[10]、鄭州[11]；顯著高于南方城市湘潭[12]、柳州[13]、陽江[14]、瓊海[15]；而與緯度接近的建始[16]、眉山[17]、麗水[18]、六盤水[19]地區的差異無統計學意義(P>0.05)。MTHFR C677T位點TT型及等位基因T頻率隨緯度增高而增高，與我國葉酸缺乏北高南低的趨勢一致。

圍生期補充葉酸可預防絕大多數NTDs的發生，但過量服用葉酸可能導致子代哮喘、腫瘤、心血管疾病等發生風險增加。根據《圍受孕期增補葉酸預防神經管缺陷指南(2017)》建議，從可能妊娠或孕前至少 3個月開始每日增補葉酸；無高危因素的女性應每日補充葉酸0.4 mg或0.8 mg(不超過1.0 mg)；有NTDs生育史或夫妻一方有NTDs病史者應每日補充葉酸4 mg；有先天性心臟病、唇腭裂等出生缺陷家族史或直系親屬中有NTDs生育史的女性，以及患有糖尿病、肥胖、癲癇、正在服用增加胎兒NTDs風險藥物、患胃腸道吸收不良疾病的女性建議每日服用0.8～1.0 mg葉酸[2]。

4 結 論

武漢地區育齡期漢族女性MTHFR和MTRR基因多態性分布具有明顯的地域特異性，有1/2以上女性存在不同程度的葉酸代謝障礙。因此常規0.4 mg/d的葉酸增補劑量不能滿足大部分女性的需要，在實施葉酸增補時，可檢測葉酸利用能力基因多態性，針對葉酸代謝缺陷的高風險人群，根據基因型、臨床特征并結合飲食結構等特點，針對葉酸增補劑量和時間進行個性化調整，從而真正達到預防出生缺陷，促進健康的目的。