廣東地區Hb New York患者血紅蛋白電泳及血常規指標分析*

潘建華，張 玲，李艷紅，何高旺，蔡秀儀

(廣州金域醫學檢驗中心血液室，廣東廣州 510330)

血紅蛋白病可分為兩大類，一類是異常血紅蛋白病，表現為血紅蛋白珠蛋白肽鏈結構異常，如血紅蛋白紐約(Hb New York)、HbE、HbG、HbQ、HbS等，據世界衛生組織的報告，全世界大約有1.5億人攜帶異常血紅蛋白病的基因[1]，該病是最為常見的一種單基因遺傳病[2]。Hb New York是中國人群中一種常見的變異血紅蛋白，屬于β鏈變異，在第113位的β珠蛋白鏈上的氨基酸結構發生改變，谷氨酸取代纈氨酸。這種替換導致了α1和β1接觸面除亞鐵血紅素組以外的區域面發生微妙變化，即致兩者血紅蛋白的電泳流動性和穩定性發生微小變化[3-6]。常見于復合珠蛋白生存障礙性貧血，嚴重者導致中度或重度貧血。另一類為珠蛋白生存障礙性貧血，是珠蛋白基因內部或其旁側序列的突變，是珠蛋白肽鏈比例失衡所致的溶血性貧血[7]。相關分子生物學研究表明，無論是異常血紅蛋白病，還是珠蛋白障礙性貧血，其分子基礎相同，都是由于珠蛋白基因的突變所致[8]。近年來，血紅蛋白病在我國發病率逐年升高，給社會與家庭帶來了巨大的壓力。目前，使用平均紅細胞體積(MCV)[9]和紅細胞滲透脆性試驗(ROFT)[10-11]結果低于參考值進行血紅蛋白病患者的初篩是較為常用的方法。因此，本文利用Hb New York血液學表型數據分析和尋找篩查Hb New York的快速方法，為疑似血紅蛋白病患者診斷和治療提供可靠的數據，同時也為預防珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生提供依據。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年3月至2018年12月在廣州金域醫學檢驗中心篩查血紅蛋白病的體檢、婚檢、孕檢的768 266例標本為病例組，其中男239 630例，女528 636例；年齡6～61歲，中位年齡28歲。選擇100例在廣州金域體檢中心體檢的健康者為對照組，男50例，女50例；中位年齡30歲；排除貧血或其他相關疾病。

1.2方法

1.2.1血常規分析 收集EDTA-K2抗凝血2.0 mL，采用貝克曼COULTER LH750全自動血細胞分析儀作血常規分析[12]。ROFT采用廣州米基公司生產的一管法，參考范圍：ROFT結果<60%，MCV>80 fL，紅細胞(RBC)為(3.5～5.5)×1012/L,平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)為27～34 pg。血紅蛋白A2(HbA2)參考范圍為1.2%～3.5%。

1.2.2血紅蛋白電泳分析 收集EDTA-K2抗凝血2.0 mL，采用美國Helena公司全自動快速電泳系統(spife-3000)，在堿性(pH=8.6)條件下電泳，由于各種血紅蛋白具有不同的等電點，可分離出各種血紅蛋白區帶，進行定性或定量檢測各種血紅蛋白區帶。同時用美國PRIMUS公司CLC385TMSystem-高效液相色譜(HPLC)或法國Sebia Capillarys毛細管電泳儀進行驗證。

1.2.3Thal基因檢測 GAP-PCR檢測3種常見的缺失型α-Thal基因(--SEA、-a3.7與-a4.2)，試劑由亞能公司提供，采用PCR結合反向點雜交法檢測β-珠蛋白基因17個位點的18種突變，試劑由深圳益生堂生物公司提供。

1.2.4珠蛋白生成障礙性貧血判斷標準 根據《血液病診斷及療效標準》[13]電泳法結果診斷α珠蛋白生成障礙性貧血時HbA2臨界值為≤2.6%，鏡檢Heinz小體陽性；診斷β珠蛋白生成障礙性貧血時HbA2臨界值為≥3.8%，以基因檢測為“金標準”。

1.2.5異常血紅蛋白判斷標準 當在電泳圖譜中出現非“A”非“S”位置時，用毛細管電泳或HPLC法驗證是快速或慢速帶具體組別。Hb New York以基因蛋白測序為“金標準”。

1.2.6β-珠蛋白基因序列擴增與測序 采用Primer premier 5.0軟件設計擴增與測序，采用英俊公司的引物，基因擴增采用寶生物公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase酶反應體系，擴增產物使用加拿大Fermentas公司的試劑進行純化，基因測序采用美國ABI公司的試劑與遺傳分析儀進行分析。β-珠蛋白基因測序結果：雜合突變發生在β鏈上，基因突變型為1161C>T多態性，1371T>AT Hb New York(HBB∶C.341T>C)突變雜合子，所使用的引物序列以beta-323Fa為正向(F)上游擴增引物，其引物序列(5′-3′)為ATGCTTACCAAGCTGTGATTCCA；beta+30Rb為反向(R)下游擴增引物，其引物序列(5′-3′)為TGGACTTAGGGAACAAAGGAACCTT；引物beta 507F，序列(5′-3′)TGGCTCACCTGGACAACC，與引物beta+30Rb，序列(5′-3′)TGGACTTAGGGAACAAAGGAACCTT配對；引物beta 1091F，序列(5′-3′)TGTATCATGCCTCTTTGCA，與引物beta+30Rb，序列(5′-3′)TGGACTTAGGGAACAAAGGAACCTT配對；引物beta-323Fa，序列(5′-3′)ATGCTTACCAAGCTGTGATTCCA，與引物beta 540R，序列CATTCGTCTGTTTCCCATT配對；引物beta-323Fa，序列(5′-3′)ATGCTTACCAAGCTGTGATTCCA，與引物beta 1088R，序列GCAAAGAGGCATGATACATT配對(注：a同時為上游擴增引物，b同時為下游擴增引物)。

1.3統計學處理 采用SPSS18.0進行統計學分析。計數資料以百分數表示，組間比較采用χ2檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Hb New York檢出情況 768 266例標本共檢出966例Hb New York，Hb New York檢出率為0.13%。Hb New York雜合子復合珠蛋白生成障礙性貧血檢出率為9.1%(88/966)，其電泳濃度<40%，ROFT結果<60%，MCV<80 fL。43.8%(423/966)的Hb New York電泳濃度<40%，ROFT結果>60%，MCV>80 fL。Hb New York雜合子復合α珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失或β珠蛋白生成障礙性貧血基因突變的檢出率為6.3%(61/966)。47.1%(455/966)Hb New York電泳濃度>40%，ROFT結果>60%、MCV>80 fL，基因檢測結果顯示，未檢出α珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失或β珠蛋白生成障礙性貧血基因突變，為單純Hb New York雜合子。

2.2血紅蛋白電泳結果 以MCV>80 fL、Hb New York電泳濃度>40%為A組，MCV<80 fL、Hb New York電泳濃度<40%為B組，MCV>80 fL、Hb New York電泳濃度<40%為C組。3組HbA2、Hb New York電泳濃度差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。Hb New York采用毛細管電泳法進行驗證的結果顯示，電泳結果未見異常。其堿性電泳結果見圖1。

表1 血紅蛋白電泳結果

注：1、3均為正常標本，2為異常血紅蛋白。圖1 Hb New York堿性電泳圖

2.3ROFT結果 A組ROFT結果(92.85%±9.08%)與對照組(93.91%±11.35%)比較，差異無統計學意義(P>0.05)；B組ROFT結果(45.0%±17.21%)與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；C組ROFT結果(81.56%±13.86%)與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。A組與B組比較，兩組ROFT結果差異有統計學意義(P<0.05)；A組與C組比較，兩組ROFT結果差異有統計學意義(P<0.05)；B組與C組比較，兩組ROFT結果差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4A、B、C組與對照組RBC、血紅蛋白、MCV、MCH的比較 4組間RBC、血紅蛋白水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。B組MCV、MCH明顯低于其他3組，差異有統計學意義(P<0.05)；A、C組和對照組間MCV、MCH比較，差異無統計學意義(P>0.05)；見表2。

表2 A、B、C組與對照組RBC、血紅蛋白、MCV、MCH的比較

2.5Hb New York不同濃度復合珠蛋白生成障礙性貧血基因類型的檢出情況 結果顯示，A組為單純Hb New York雜合子，未檢出α珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失或β珠蛋白生成障礙性貧血基因突變；B組Hb New York雜合子復合α珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失12例，復合β珠蛋白生成障礙性貧血基因突變76例；C組Hb New York雜合子復合α珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失22例，復合β珠蛋白生成障礙性貧血基因突變39例。見表3。

表3 Hb New York雜合子復合珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結果[n(%)]

3 討 論

本研究結果顯示，廣東地區Hb New York檢出率為0.13%，與溫應方等[14]報道的結果差異較大，與李友瓊等[15]結果相近，可能與標本來源不同有關。Hb New York在電泳圖譜上屬于K組，突變發生于α1和β1接觸面，屬于輕度不穩定蛋白，大多數Hb New York基因攜帶者無明顯臨床癥狀。關于Hb New York的起源，較多研究者認為起源于客家人[16-18]。本研究是建立在血液學表型和基因型分析結果一致的情況下進行的，可以進一步地了解廣東地區Hb New York起源。結果顯示，經堿性血紅蛋白電泳篩查出的異常Hb New York共966例，經測序證實與血紅蛋白電泳完全符合，且均為Hb New York(HBB∶C.314T>C)突變雜合子，其中817例為單純Hb New York突變雜合子，患者血液學檢測指標基本無變化，只有在電泳時在HbA上方出現Hb New York。本研究中的B組患者即Hb New York雜合子復合珠蛋白生成障礙性貧血患者，均有不同程度的貧血癥狀表現，MCV、MCH、ROFT明顯降低，同時還可見Hb New York的濃度也降低，但RBC、血紅蛋白及HbA2結果均在參考范圍內，無明顯血液學表現。

Hb New York患者血常規指標(RBC、血紅蛋白、MCV、MCH)正?；蚱?，外周血涂片顯示中度小紅細胞癥，臨床易被診斷為缺鐵性貧血。當瓊脂糖堿性(pH=8.6)電泳圖在緊鄰HbA上方出現非“A”位置異常血紅蛋白時，有必要用另外一種酸性電泳方法(pH=6.5)或HPLC、毛細管電泳去驗證排除該變異為Hb New York的可能性。若存在，則Hb New York從HbA分離向陽極移動，而HPLC不能很好地將其分開，因為在HPLC中，Hb New York和HbA的保留時間幾乎一致。因此，篩查Hb New York或排除Hb New York復合珠蛋白生成障礙性貧血時，可通過Hb New York在堿性和酸性瓊脂凝膠電泳中的相對移動速度初步驗證發現的異常Hb New York，試驗條件充足時可以用蛋白測序的方法確證。但雜合子的Hb New York患者通常情況無臨床癥狀，不會致病，因此，若排除珠蛋白生成障礙性貧血的夫妻雙方，可以不用再做下一步的測序，減輕了患者經濟負擔。反之，需要排除Hb New York復合珠蛋白生成障礙性貧血的可能性，避免夫妻同型生育重型珠蛋白生成障礙性貧血兒的風險，可為臨床提供可靠的診斷依據。

而糖化血紅蛋白(HbA1c)的測定會受到變異血紅蛋白的干擾，使HbA水平下降，從而導致HbA1c的結果受到干擾，且變異血紅蛋白也會被糖化，因此，如果患者檢測出異常血紅蛋白時，需把正常的HbA1c與變異血紅蛋白糖化的部分相加才為HbA1c結果[19]。另有文獻報道，血小板計數也會因為異常血紅蛋白受到干擾[20]。因此，在血紅蛋白病高發的地區，建議采用ROFT、紅細胞參數檢測、堿性血紅蛋白電泳進行聯合初篩，同時對篩查出的異常血紅蛋白進行驗證以示區別。本文對部分Hb New York基因測序進行確診Hb New York基因突變雜合子，符合率達100%?？梢姡t蛋白電泳聯合ROFT及血常規檢測可作為篩查Hb New York的一種較好且快速、簡便的方法。

4 結 論

不同電泳濃度的Hb New York血常規指標有所差異，廣東地區人群Hb New York以單純雜合子多見，其血常規指標多表現正常。復合珠蛋白生成障礙性貧血時，Hb New York患者可表現為缺鐵性貧血。