ICP-MS法測定人全血中19種微量元素的性能評價及臨床應用*

李 悅，豆小文，紀 翔，熊 丹，王萌萌，宗曾艷，陳大洋，張秀明

(深圳市羅湖醫院集團醫學檢驗實驗室/深圳大學第三附屬醫院醫學檢驗科，廣東深圳 518001)

微量元素是人體生長代謝必不可少的重要組成部分，參與多種酶、激素、維生素和核酸等代謝過程，影響諸多疾病的發展和進程。了解人體內微量元素缺乏或蓄積中毒情況，可輔助臨床制訂診療方案，為特殊人群提供準確、快速的診斷依據。孕婦是最易發生微量元素缺乏的人群之一，主要由于胎兒需要從母體吸取更多的營養物質，因此微量元素的監測可作為評估孕婦營養狀態的一項重要指標。CHOI 等[1]通過研究發現，孕婦與一般人群相比，血液中的銅(Cu)和鈷(Co)水平偏高，鋅(Zn)、硒(Se)水平則偏低，并且Cu水平偏低與子癇前期患病率相關，維持Cu和Zn的最佳水平可降低自然流產率[2]。Fe和Zn水平降低合并有毒重金屬元素存在時是先兆流產的重要診斷依據和預后評價指標[3]。近年來有研究顯示，妊娠早期血清低水平Cu元素可能導致妊娠高血壓的患病風險升高[4]。此外，孕婦體內微量元素的缺乏會引起免疫力下降、睡眠質量差、貧血等癥狀，甚至導致胎兒畸形等嚴重后果[5]，最終影響妊娠結局。因此，定期進行體內微量元素水平監測，有助于評估臨床孕期女性的營養狀況，輔助診斷與元素過量或缺乏相關的疾病，指導孕婦合理補充微量元素。

目前微量元素檢測方法諸多，包括溶出伏安法[6]、X射線熒光法[7]、中子活化分析法[8]、原子吸收光譜法(AAS)[9]、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[10]等。其中ICP-MS將電感耦合等離子體的高溫電離特性與四極桿的靈敏快速篩選掃描的優點相結合，具有超高靈敏度、多元素高通量檢測等優勢，可在幾分鐘內定量測定幾十種元素，是現階段研究人體元素含量最有效的工具之一，廣泛應用于各類疾病的金屬組學研究中。徐鳳仙等[11]研究妊娠期女性5種微量元素在不同孕期的差異，曹清蕓等[12]采用大樣本量對不同孕期和年齡的孕婦的5種微量元素進行統計分析，指出需要重視孕期合理補充微量元素。但目前關于孕婦血液中19種微量元素的研究則鮮有報道。本研究參考美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)EP系列文件和質譜應用共識對ICP-MS檢測19種微量元素的性能進行評價[13-14]。此外，為了解孕婦體內微量元素的代謝特征，本研究對358例孕婦的微量元素進行分析，比較孕婦不同年齡段和不同孕期19種微量元素結果的差異，為孕婦微量元素的監測提供重要依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019—2020年在本院產科門診或婦科門診就診的孕婦358例作為研究對象，排除心、肝、肺等器質性疾病。孕婦年齡19～43歲，中位年齡30歲。根據年齡分為非高齡組孕婦(<35歲)285例和高齡組孕婦(≥35歲)73例；按照孕周分為妊娠早期組(<13周)276例和中晚期組(≥13周)82例。分析不同組別孕婦19種微量元素[鋰(Li)、鎂(Mg)、鈣(Ca)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、Cu、Zn、Se、鍶(Sr)、鉬(Mo)、鎘(Cd)、汞(Hg)、鉛(Pb)、釩(V)、Co、砷(As)、鉈(Tl)、鉍(Bi)]水平的差異。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 ICP-MS儀(美國安捷倫公司，Agilent 7900)，超純水機(法國威立雅公司，PURELAB Chorus 1)，自動進樣器(美國Teledyne CETAC，ASX-560)，多管漩渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司，MTV-100)，高純氬氣(Ar>99.999%)和氦氣(He>99.999%，深圳高發氣體)，超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司，AS7240A)。肝素鈉專用微量元素采血管(廣州陽普醫療科技股份有限公司，2 mL)。

1.2.2試劑 65%硝酸(MERCK，LC-MS級)，曲拉通X-100和金離子標準溶液(Macklin，微量元素級別)，多種微量元素標本稀釋液(含質控、標準曲線和內標，杭州佰勤醫療器械有限公司)，調諧液(美國安捷倫公司)，實驗用水由超純水機制備(高純水電阻率為18 MΩ·cm)。

1.2.3儀器工作條件 等離子體氣體15 L/min，輔助氣體1 L/min，霧化氣1 L/min，補償/稀釋氣體1 L/min，霧化室溫度2 ℃；IF/BK真空度1.99E+2 Pa，射頻功率1 550 W，八級桿偏轉電壓為-18 V，采樣深度8 mm；校準方法采用標準加入模式，分別選用鈧(Sc)、釔(Y)、銠(Rh)、銦(In)、鋱(Tb)為內標元素。

1.3方法 采集孕婦靜脈血2 mL至微量元素專用肝素鈉抗凝采血管中，標本稀釋后即可進行ICP-MS分析。

1.3.1標本測定 打開儀器，待真空度達到要求，用調諧液調諧儀器各項指標，包括靈敏度、穩定性、背景、離子透鏡調諧參數等，確保儀器各方面指標達到要求，再進行批處理前調諧，使響應計數、相對標準偏差(RSD%)、氧化物、雙電荷、分辨率等均達到要求，將制備好的標液、質控、標本依次編號測定。取100 μL充分混勻的血樣或質控品加入3 900 μL標本稀釋液，3 000 r/min振蕩10 min后進行ICP-MS分析。

1.3.2方法學評價 實驗操作人員必須經過專業的儀器和項目培訓，熟練掌握儀器的使用、維護，熟悉儀器各方面性能指標，按照《ISO15189:2012醫學實驗室質量和能力認可準則》的要求建立質量管理體系，對儀器進行定期校準、調諧和維護，規范工作流程，做好實驗室各環節的質量控制，保證結果準確可靠。

1.3.5檢出限和定量限 依據質譜應用共識和JJF 1159-2006四極桿電感耦合等離子體質譜儀校準規范[14-15]，吸取21份4 mL超純水分別于5 mL的Ep管中。將第1份超純水空白經ICP-MS測定后作為背景響應，其余20份空白標本扣除第1份超純水背景本底響應后，計算20份超純水測定結果的3倍標準偏差作為檢出限(LOD)。定量限(LOQ)是以10倍的標準偏差和線性水平最低點進行評估，而實際臨床工作中結合臨床參考范圍，為滿足正確度和精密度要求，將線性范圍下限作為預估的定量限。將微量元素LOQ水平平行測定10次(n=10)，計算19種微量元素的LOQ相對偏倚(Bias)和CV。定量限的Bias在±15%內，CV≤15%為滿足要求，在此條件下，計算19種微量元素的LOD。

1.3.6線性范圍 選取多種微量元素基底液(L0)、標準曲線L1～L6標液(由低水平到高水平6個水平點)從2～8 ℃環境取出恢復至室溫，2 000 r/min離心，10 min后直接進行ICP-MS分析，以標準溶液中各化合物的峰面積與內標化合物的峰面積的比值(相對響應比率)為縱坐標，以標準溶液中各化合物相應的水平為橫坐標進行線性回歸，獲得各元素的線性回歸方程和相關系數。若相關系數r≥0.995，說明19種微量元素的水平與相對響應比率線性關系良好。

1.3.7穩定性 穩定性對檢測結果的可重復性、可靠性產生影響，可采用高、低水平考察19種微量元素不同儲存條件下的穩定性。根據臨床血液標本水平和標準物質添加法制備高、低水平微量元素混合血液標本，分別將低水平和高水平標本分裝成30份，每份100 μL。將混合血液標本分別放置冷藏(2～8 ℃，5 d)和室溫(20～26 ℃，3 d)，每種條件下每次分別取出6份(n=6)，測定19種微量元素的低、高水平血液標本在冷藏條件下1、3、5 d和室溫條件下1、3 d的結果，將第1天測試的結果作為初始測定值，計算19種微量元素的平均值，與初始測定值比較，Bias≤15%為符合要求。

2 結 果

2.1正確度 19種微量元素的正確度結果見表1，根據試驗數據計算得出微量元素的驗證區間，結果顯示廠家提供的靶值在驗證區間內，因此ICP-MS測定19種微量元素的正確度得到了驗證，結果符合要求。

表1 ICP-MS檢測19種微量元素的正確度結果(n=5)

2.2精密度 ICP-MS檢測19種微量元素高、低兩水平的批內CV、實驗室內CV、S和總CV結果見表2，批內和實驗室內CV≤7.72%，符合試劑盒廠商驗證要求。

2.3LOD與LOQ ICP-MS測定19種微量元素的LOD與LOQ結果見表3，LOQ的Bias≤15%，CV≤13.46%，LOQ結果滿足要求，在此條件下，19種微量元素的LOD見表3。

表3 ICP-MS測定19種微量元素的線性范圍、LOD和LOQ結果(n=10)

2.4線性范圍 ICP-MS測定多種元素的線性范圍結果見表3，19種微量元素的水平與相對響應比率具有良好的線性關系，r≥0.995。

2.5穩定性 ICP-MS測定19種微量元素的穩定性結果見圖1，圖中可見19種微量元素的Bias≤15%，因此檢測微量元素的標本可冷藏保存5 d、室溫保存3 d，水平未發生顯著改變，滿足實驗室標本一般保存要求。

注：A為低水平血液標本；B為高水平血液標本。圖1 ICP-MS測定19種微量元素的穩定性(n=6)

2.6臨床標本分析 結果顯示，非高齡組和高齡組Mg、Tl水平差異有統計學意義(P<0.05)，妊娠早期組和妊娠中晚期組Mg、Cu、Mn、Co水平差異有統計學意義(P<0.05)，其他元素在年齡和孕周分組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 ICP-MS測定358例孕婦19種微量元素水平的比較

續表4 ICP-MS測定例孕婦19種微量元素水平的比較

組別nHg[μg/L,M(P25,P75)]V[μg/L,M(P25,P75)]Co[μg/L,M(P25,P75)]As[μg/L,M(P25,P75)]Tl[μg/L,M(P25,P75)]Bi[μg/L,M(P25,P75)]Cd[μg/L,M(P25,P75)]非高齡組2851.67(1.20,2.57)0.00(0.00,0.06)0.10(0.07,0.17)1.70(1.01,3.90)0.05(0.04,0.08)0.00(0.00,0.01)1.03(0.80,1.33)高齡組731.73(1.07,2.82)0.00(0.00,0.07)0.10(0.06,0.17)1.41(0.92,2.64)0.05(0.03,0.06)0.00(0.00,0.00)0.93(0.72,1.23)P0.7540.2650.9420.1250.0430.3260.147妊娠早期組2761.71(1.18,2.74)0.00(0.00,0.06)0.09(0.06,0.16)1.55(1.01,3.21)0.05(0.03,0.07)0.00(0.00,0.01)1.01(0.78,1.30)妊娠中晚期組821.59(1.13,2.26)0.00(0.00,0.08)0.13(0.09,0.26)1.75(0.95,4.14)0.05(0.04,0.08)0.00(0.00,0.01)0.99(0.80,1.32)P0.2090.488<0.0010.6000.0510.7780.963

3 討 論

本研究參考ISO15189和CLSI EP文件中關于檢測方法性能驗證的相關內容對ICP-MS測定19種微量元素的分析性能進行系統性的評價。19種微量元素水平與相對響應比率在檢測范圍內具有良好的線性關系(r≥0.995)。通過對該方法正確度和精密度考察發現符合驗證要求，在滿足臨床標本檢測范圍的前提下，LOQ符合要求，ICP-MS采用的標本冷藏和室溫保存方法對19種微量元素標本進行檢測具有良好的穩定性。此外，本研究以Sc、Y、Rh、In、Tb 5種元素作為內標，在標本處理中采用直接稀釋法可滿足簡便、快速測定微量元素的要求，可有效避免復雜前處理可能帶來的標本損失和引入污染[16]。試驗中所采用的標本量僅100 μL，在2 min內即可實現臨床標本中19種微量元素的高通量準確測定。

在研究過程中發現，由于部分微量元素在人體內水平較低，易受多種因素影響，因此做好分析前、中、后的質量控制對于保證檢測結果真實、可靠至關重要。有研究證實，采血管的選取對微量元素結果影響很大，主要是由采血管材質、抗凝劑、采血管帽中元素的殘留等造成的[17]。有研究發現，檢測前對實驗室采血管進行本底值檢測利于降低污染率[18]，若采血管中殘留的目標元素低于血液微量元素最小值的10%或低于LOD則符合使用要求。在對實際臨床標本進行檢測的過程中還發現，Cr、Mo及Hg 3種元素在檢測中易殘留，需采取措施來降低殘留污染。本研究中采用的方法為在含有硝酸的洗針液中加入少量的金溶液和曲拉通，這有助于降低微量元素在清洗過程后的殘留。試驗過程發現Cr和Mo元素易受到外界環境干擾，本底空白的響應值增高可能影響質控和臨床標本結果準確性，因此對這兩種元素在臨床標本中的含量進行測定時需要保證實驗環境的潔凈和無塵，并注意防潮，盡量避免引入外源性污染[10]。

為了拓展ICP-MS在臨床檢測中的應用，本研究采用該方法對收集到本院的孕婦全血標本進行檢測，通過對不同年齡段和不同孕期孕婦研究發現血液中Mg元素水平差異有統計學意義(P<0.05)。高齡孕婦由于年齡較大，代謝速度有不同程度的降低，可能導致不同年齡段Mg元素的水平不同。從檢測結果中可看出，處于妊娠中晚期的孕婦血液中Mg元素水平比妊娠早期略有降低，這可能是由于在妊娠中晚期胎兒在成熟過程中對Mg元素的需要量增加造成的，因此在妊娠中晚期需要適量增加一些富含Mg元素的食物，如蔬菜、堅果、谷類等的攝入。Tl元素是人體非必需微量元素，傳統的檢測方法難以監測，本研究利用ICP-MS檢測發現該元素在高齡組與非高齡組血液中的水平差異有統計學意義(P<0.05)，這種差異可能為不同年齡段孕婦體內的激素和代謝水平不同，或與環境接觸污染及累積效應有關。有相關研究顯示，隨著工業的發展和人口的急劇增長，環境污染造成的體內重金屬元素富集愈加嚴重，孕婦應避免接觸重金屬污染的環境，尤其是As、Mn、Pb、Cd等污染的地區[19-20]，因此對包括Tl在內的多種重金屬元素在孕婦體內的水平進行檢測，對保證孕期女性和胎兒的健康至關重要。本研究同時發現，妊娠中晚期組體內Cu元素水平高于妊娠早期組，差異有統計學意義(P<0.05)。有研究表明，妊娠期女性血液中的Cu元素水平明顯高于非孕期，可能與妊娠期雌激素增高刺激肝臟合成銅藍蛋白有關，或由于妊娠期典型的激素變化而導致膽道對Cu排泄減少[21]。此外，本研究發現處于妊娠早期和中晚期的兩組孕婦血液中Mn元素水平差異有統計學意義(P<0.05)。有文獻報道孕婦處于臨近分娩時體內的Mn水平明顯高于妊娠早期[22]，這與本研究的數據一致。由于Mn是人體必需微量元素，主要來源于食物、環境等，負責碳水化合物、氨基酸和膽固醇的正常代謝，孕期母體Mn元素的缺乏會導致新生兒發生支氣管哮喘、軟骨發育不良等后果，而過量的Mn元素則可導致孕婦頭暈、乏力等癥狀，因此定期監測Mn元素是否存在缺乏或過量對孕婦的健康至關重要。本研究發現，妊娠早期與妊娠中晚期的女性體內的 Co元素水平差異有統計學意義(P<0.05)，妊娠中晚期高于妊娠早期，這與文獻報道的結果一致[1]。Co是維生素B12的重要組成部分，能通過影響腎臟釋放促紅細胞生成素，刺激紅細胞生成，是一種獨特的營養物質，與體內激素和代謝物質有關，Co的過量攝入會導致呼吸困難、全身疲倦等。此外，孕婦在妊娠期不同階段對微量元素的需求有所不同，這就需要通過精準、快速、準確的微量元素檢測結果作為依據，從而為孕婦提供個性化的微量元素攝入指導，提示孕產婦應對自身營養進行合理補充，必要時進行藥物干預。

4 結 論

綜上所述，ICP-MS在檢測人全血中19種微量元素時具有良好的分析性能，具有精密度高、準確度好、線性范圍寬，以及臨床標本結果測定準確、可靠等優勢，可用于大批量臨床標本的檢測。本研究發現年齡和孕周是導致孕婦體內部分微量元素水平產生差異的重要影響因素，探討孕婦微量元素的水平變化有利于指導合理、及時補充微量元素，避免微量元素缺乏或過量中毒，降低妊娠期疾病和胎兒不良結局的發生率，對產前診斷具有重要價值。本研究中孕期女性微量元素水平檢測的對象主要來自深圳市羅湖區，雖然對不同孕期和年齡的研究對象進行了研究但仍具有一定區域局限性，并計劃在后期擴大樣本量進行深入研究，進一步有針對性地評估孕婦營養情況、血清水平和妊娠結局之間的關系。