趙桂梅，周汶靜，王 念，鄭 沁，周 娟，周 易，葉遠(yuǎn)馨△

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041；2．中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九一○醫(yī)院檢驗科，福建泉州 362000)

急性粒-單核細(xì)胞白血病(以下簡稱“急性粒單白血病”)是一類粒細(xì)胞和單核細(xì)胞以不同比例同時存在于骨髓和外周血中的急性髓細(xì)胞白血病(AML)，占所有AML的5%～10%。大多數(shù)AML是由于獲得性造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基因突變所致。基因的突變可表現(xiàn)為染色體的異常，其中inv(16)(p13；q22)是比較常見的異常核型，多見于5%～8%的AML初治患者[1]，且M4EO型常見[2]。此染色體倒位可導(dǎo)致編碼核結(jié)合因子B單位基因(CBFB)和編碼平滑肌肌球蛋白鏈基因(MYH11)發(fā)生重組，形成CBFB-MYH11融合基因[3]。由于此融合基因僅出現(xiàn)在AML中，故可用于AML的診斷。國內(nèi)外部分研究表明該融合基因的出現(xiàn)是預(yù)后較好的標(biāo)志[4-6]，并可作為急性粒單白血病復(fù)發(fā)監(jiān)測的重要指標(biāo)[7]，但其與急性粒單白血病各項臨床特征的關(guān)系卻少有報道。為了更全面地了解CBFB-MYH11融合基因與急性粒單白血病各項臨床特征之間的關(guān)系，本文對123例急性粒單白血病患者進(jìn)行回顧性分析，探討CBFB-MYH11融合基因與急性粒單白血病實驗室指標(biāo)、臨床癥狀、治療效果及生存時間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2009年1月至2019年9月在四川大學(xué)華西醫(yī)院確診的急性粒單白血病患者123例為研究對象。將34例CBFB-MYH11融合基因陽性者作為陽性組，其中男20例，女14例；年齡15～70歲，中位年齡41歲。將89例CBFB-MYH11融合基因陰性者作為陰性組，其中男52例，女37例；年齡24～76歲，中位年齡44歲。兩組年齡、性別構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者依據(jù)《血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行診斷[8]。

1.2方法

1.2.1實驗室指標(biāo)的檢測 采用EDTA抗凝真空采血管采集2 mL靜脈血，應(yīng)用Sysmex XE2100全自動血細(xì)胞分析儀檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞千分比、白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、單核細(xì)胞絕對值、單核細(xì)胞百分比、原始細(xì)胞絕對值、原始細(xì)胞百分比。采用枸櫞酸鈉抗凝真空采血管采集2 mL靜脈血，應(yīng)用Sysmex CA7000血凝分析儀檢測纖維蛋白原(FIB)。采用無抗凝劑的真空采血管采集4 mL靜脈血，應(yīng)用羅氏Cobas 8000檢測胱抑素C(Cys-C)、乳酸脫氫酶(LDH)、羥丁酸脫氫酶(HBDH)。采用骨髓涂片并用瑞吉染色法進(jìn)行染色，在油鏡下人工計數(shù)200個有核細(xì)胞并進(jìn)行分類，計算骨髓原始粒細(xì)胞、原始單核細(xì)胞、幼稚單核細(xì)胞占有核細(xì)胞的百分比，以及骨髓粒紅比。采用肝素抗凝管抽取骨髓2～3 mL，應(yīng)用BD-FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀分析CD13、CD117、CD56、CD64、CD14、CD33、細(xì)胞質(zhì)髓過氧化物酶(cMPO)、CD34、人類白細(xì)胞抗原(HLA-DR)、CD36、CD19、CD7。取患者EDTA抗凝的骨髓標(biāo)本2～3 mL，應(yīng)用Taqman-MGB探針法，使用Roche Light Cycler 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR分析儀及上海源奇生物試劑盒檢測CBFB-MYH11融合基因；應(yīng)用一代測序方法采用Applied BiosystemsTM3500 Dx基因分析儀及上海源奇生物試劑盒檢測預(yù)后突變基因(FLT3、NPM1、C-KIT、DNMT3A、CEBPa)。以上檢查指標(biāo)均為初診白血病患者的首次檢查結(jié)果，各項指標(biāo)檢查時間不超過1周。

1.2.2臨床癥狀的觀察 觀察患者發(fā)病初期是否出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、出血、肝脾淋巴結(jié)腫大、骨痛、牙齦增生等癥狀。

1.3治療方案及療效判定 確診后采用標(biāo)準(zhǔn)的IDA(伊達(dá)比星+阿糖胞苷)、DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)方案進(jìn)行治療。療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、無緩解(NR)、復(fù)發(fā)(RLP)，判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)(第3版)》[9]：CR，原始粒細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型+原始及幼稚單核細(xì)胞≤5%；PR，原始粒細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型+原始及幼稚單核細(xì)胞>5%且≤20%；NR/治療失敗，原始粒細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型+原始及幼稚單核細(xì)胞>20%；RLP，骨髓原始粒細(xì)胞Ⅰ型+Ⅱ型(原始單核細(xì)胞+幼稚單核細(xì)胞)>5%且≤20%。排除未經(jīng)化療或進(jìn)行骨髓移植的病例。

1.4隨訪 自確診之日起開始隨訪，死亡病例隨訪至死亡，存活病例隨訪至2019年9月，失聯(lián)病例隨訪至最后一次在院檢查時間。制作生存曲線，分析CBFB-MYH11融合基因?qū)傮w生存時間和無復(fù)發(fā)生存時間(時間定義為自達(dá)到無白血病癥狀起至患者死亡、復(fù)發(fā)或末次隨訪檢查時間為止)的影響[9]。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。非正態(tài)分布的計量資料采用M(P5，P95)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者實驗室指標(biāo)分析 陽性組PLT水平顯著低于陰性組，而Cys-C水平和骨髓粒紅比顯著高于陰性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其余指標(biāo)兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組的CD13、CD117、CD33、CD34、HLA-DR、cMPO陽性率均在83%以上，CD36、CD64陽性率為45%～65%，CD14、CD56陽性率為20%～35%；CD19陽性率<10%。兩組間CD7陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。陽性組中16例進(jìn)行了預(yù)后基因檢測，有5例發(fā)生基因突變，主要突變類型是C-KIT(2例)、FLT3-TKD(2例)、FLT3-ITD(1例)；而陰性組中37例進(jìn)行了預(yù)后基因檢測，有26例發(fā)生基因突變，DNMT3A有11例，F(xiàn)LT3-ITD有11例，NPM1有11例，CEBPA單、雙突變各2例，F(xiàn)LT3-TKD和KRAS各1例。其中同時檢測出2～3個基因突變的有10例。陽性組伴預(yù)后基因突變的陽性率(31.25%)低于陰性組(70.3%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008)。見表1。

表1 兩組間實驗室指標(biāo)差異分析

組別nHGB[g/L,M(P5,P95)]PLT[×109/L,M(P5,P95)]單核細(xì)胞絕對值[×109/L,M(P5,P95)]單核細(xì)胞百分比[%,M(P5,P95)]陽性組3477.5(42.7,123.9)27.0(5.7,99.2)2.395(0.760,*)12.0(1.0,*)陰性組8980.0(54.0,133.8)64.0(6.0,189.5)1.470(0.058,19.585)9.0(1.0,31.8)P0.898<0.0010.1300.854

組別n外周血原始細(xì)胞絕對值[×109/L,M(P5,P95)]外周血原始細(xì)胞百分比[%,M(P5,P95)]FIB[g/L,M(P5,P95)]Cys-C[mg/L,M(P5,P95)]陽性組3463.26(3.00,*)73(18,*)3.525(0.937,6.954)1.85(0.98,3.20)陰性組8916.17(0.33,177.55)50(8,89)4.08(2.191,7.416)1.17(0.67,2.17)P0.2940.4790.4550.005

組別nLDH[U/L,M(P5,P95)]HBDH[U/L,M(P5,P95)]骨髓原始單核細(xì)胞[%,M(P5,P95)]骨髓幼稚單核細(xì)胞[%,M(P5,P95)]陽性組34524.0(235.4,1 616.2)437.0(176.2,1 296.6)28.5(7.5,81.0)14.0(1.4,44.0)陰性組89426.0(164.6,2 294.8)375.0(128.4,2 122.2)28.0(3.3,78.7)8.0(0.8,47.5)P0.6260.9460.8740.333

組別n骨髓原始粒細(xì)胞[%,M(P5,P95)]骨髓粒紅比[M(P5,P95)]免疫分型(%)CD13CD117CD56陽性組3425.0(12.9,60.3)16.8(1.0,81.1)100.0100.022.7陰性組8928.0(1.0,81.0)2.0(0.0,9.0)98.294.930.2P0.1380.0471.0000.5940.512

組別n免疫分型(%)CD64CD14CD33cMPOCD34HLA-DRCD36CD19CD7陽性組3459.330.496.2100.0100.0100.060.04.30.0陰性組8964.635.394.995.083.691.745.29.344.3P0.5160.6831.0000.9090.0850.3260.3260.7860.001

2.2兩組發(fā)病初期臨床癥狀的比較 發(fā)病初期，陽性組有18例伴有一定臨床癥狀，陰性組有89例伴有一定臨床癥狀。陽性組與陰性組發(fā)病初期均表現(xiàn)為發(fā)熱、出血、貧血、肝脾淋巴結(jié)腫大及牙齦增生。其中陰性組貧血發(fā)生率高于陽性組，而肝脾淋巴結(jié)腫大發(fā)生率低于陽性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組發(fā)病初期臨床癥狀發(fā)生率的比較(%)

2.3療效分析

2.3.1兩組整體療效分析 結(jié)果顯示，陽性組CR率為78.9%，RLP率為21.1%，均高于陰性組(45.1%、7.8%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陰性組PR率為23.5%，NR率為23.5%，均高于陽性組(0.0%、0.0%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.2達(dá)到CR的時間分析 陽性組達(dá)到CR的中位時間為27 d，短于陰性組的59 d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。

2.4生存分析

2.4.1兩組總體生存時間和無復(fù)發(fā)生存時間的比較 陽性組的總體生存時間(93.3個月)長于陰性組(76.7個月)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)。對于兩組達(dá)到CR的患者，陽性組無復(fù)發(fā)生存時間為23.8個月，稍長于陰性組(22.4個月)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.613)。

2.4.2COX比例風(fēng)險回歸模型分析 將年齡、性別、CBFB-MYH11、CD7、CD56、WBC、PLT、骨髓粒紅比、骨髓原始單核細(xì)胞百分比、外周血原始細(xì)胞百分比、網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞千分比、Cys-C、貧血作為急性粒單白血病患者總體生存時間的預(yù)后影響因素建立COX比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。首先對各指標(biāo)進(jìn)行單變量建模分析，初篩得到模型建立有意義(P<0.05)的5個變量為年齡、性別、CBFB-MYH11、CD56、貧血，將5個變量一同代入模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CD56、年齡、CBFB-MYH11融合基因為影響總體生存時間的因素(P=0.010、0.011、0.035)，即CD56陽性和年齡的增長可縮短總體生存時間，而CBFB-MYH11融合基因為陽性時可延長總體生存時間。

3 討 論

inv(16)(p13；q22)可產(chǎn)生CBFB-MYH11融合基因。而編碼核結(jié)合因子B單位基因(CBFB)和編碼平滑肌肌球蛋白鏈基因(MYH11)發(fā)生斷裂重組時，由于斷裂點(diǎn)的不同，可形成至少12種不同的CBFB-MYH11融合基因轉(zhuǎn)錄本[10]。其中85%以上是A型，其次D型和E型分別占5%，以及B、C、E-K型等[11]。本研究中所檢測的CBFB-MYH11融合基因包含A、D、E型，涵蓋了95%以上的型別。

本研究中CBFB-MYH11融合基因陽性的人群以中年人為主，中位年齡41歲，男性多于女性，發(fā)病初期臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、出血、貧血、肝脾淋巴結(jié)腫大及牙齦增生為主。其中陽性組的貧血發(fā)生率顯著低于陰性組(P<0.05)，而肝脾淋巴結(jié)腫大發(fā)生率高于陰性組(P<0.05)。實驗室檢查結(jié)果顯示，陽性組與陰性組RBC和HGB比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。考慮原因一方面可能為由于門診病例僅有實驗室指標(biāo)而無病史資料導(dǎo)致的統(tǒng)計數(shù)據(jù)偏差，另一方面可能與患者個人主觀耐受性不同有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，陽性組PLT水平顯著低于陰性組，且陽性組出血發(fā)生率稍高，與臨床表現(xiàn)相符。本研究同時發(fā)現(xiàn)，陽性組Cys-C水平顯著高于陰性組(P<0.05)，可能原因與白血病導(dǎo)致有核細(xì)胞增多，產(chǎn)生的Cys-C隨之增多有關(guān)，同時，可能與陽性組骨髓粒紅比升高有關(guān)。此外，有文獻(xiàn)報道顯示，急性白血病患者的血清LDH和HBDH高于健康人群，且與外周血WBC水平有關(guān)[12]。本研究中陰性組和陽性組血清LDH和HBDH均顯著升高，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與兩組WBC升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義一致。

已有研究報道，急性粒單白血病患者高表達(dá)CD13、CD117、CD33、CD34、HLA-DR，CD64表達(dá)陽性率超過60%，CD14呈中、低度表達(dá)，淋巴細(xì)胞系單抗原表達(dá)陽性率小于20%[13]，與本研究結(jié)果基本一致。此外，還有文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示，CD7抗原很少出現(xiàn)在預(yù)后好的AML核型組，該抗原的表達(dá)是AML預(yù)后不良的一項指標(biāo)[14-15]。而本研究中CD7在陽性組中不表達(dá)，顯著低于陰性組(P<0.05)，也與上述報道一致。

細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML細(xì)胞內(nèi)CEPBA、FLT3、NPM1、KIT、NRAS等基因可能發(fā)生突變。在核型正常的白血病中，這些基因?qū)Π籽〉念A(yù)后均產(chǎn)生一定影響，而對核型異常的AML，有關(guān)這些預(yù)后基因在其中作用的報道還比較少。國外有研究報道了人類酪氨酸激酶受體基因KIT和FLT3，以及原癌基因N-RAS和K-RAS的突變率在inv(16) AML患者中高達(dá)70%，可能為白血病形成中的協(xié)同因子[16]，C-KIT突變約占30%[17]。而本研究中陽性組伴預(yù)后基因突變的陽性率為31.25%，其中12.5%(2/16)為C-KIT突變，18.75%(3/16)為FLT3突變，低于上述文獻(xiàn)報道，可能與本研究中預(yù)后基因檢測率較低有關(guān)。而有學(xué)者研究結(jié)果顯示，C-KIT突變與核心結(jié)合因子AML患者的復(fù)發(fā)有一定關(guān)系[17]，故在CBFB-MYH11融合基因陽性患者中檢測預(yù)后基因突變具有一定必要性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，陽性組與陰性組通過標(biāo)準(zhǔn)的IDA、DA化療方案治療后，療效存在一定差異。陽性組CR率為78.9%，RLP率為21.1%，均高于陰性組(45.1%、7.8%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外陽性組達(dá)到CR的時間也顯著短于陰性組(P<0.05)。由此可以看出，CBFB-MYH11融合基因陽性患者對化療藥物敏感，CR率高，與文獻(xiàn)[7]報道一致。在生存時間分析中，陽性組總體生存時間長于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而無復(fù)發(fā)生存時間兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與文獻(xiàn)報道基本一致[7]。表明CBFB-MYH11融合基因陽性對長期生存有利，是預(yù)后較好的指標(biāo)。同時，本研究COX風(fēng)險回歸模型也顯示，CBFB-MYH11融合基因為陽性時可延長總體生存時間。COX風(fēng)險回歸模型中CD56陽性是影響生存時間的不利因素，而國內(nèi)外均有報道認(rèn)為CD56陽性的AML患者復(fù)發(fā)率高[17]。此外，發(fā)病年齡越大，生存時間越短。可能原因為患者年齡較大，身體免疫功能受到影響，患者易患疾病、用藥局限、化療耐受性較差等。

4 結(jié) 論

本研究對CBFB-MYH11融合基因陰性組和陽性組急性粒單白血病患者的實驗室指標(biāo)、臨床癥狀、療效和生存時間等進(jìn)行分析，不僅為CBFB-MYH11融合基因在急性粒單白血病發(fā)病機(jī)制的作用研究提供了依據(jù)，還進(jìn)一步證實了其在預(yù)后中的積極作用。但由于樣本量較少，以及長期隨訪較為困難，可能對某些實驗室指標(biāo)和生存時間的判斷產(chǎn)生一定影響。未來仍需積累更多的病例資料，進(jìn)行深入分析。