乳制品摻假現狀與穩定同位素鑒別技術研究進展

易冰清，郭秀秀，顏 治，趙瓊暉，吳鳳琪，靳保輝，謝麗琪，吳 浩

(1.深圳海關 食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045；2.廈門大學 環境與生態學院，福建 廈門 361005)

乳制品的摻假對世界范圍內乳品工業的發展來說都是急需解決的問題[1]，其對保障乳品的食品安全具有重要的意義。隨著經濟和技術的發展，目前我國已成為全球第三大產奶國，同時也是乳制品進口大國，是人均消費量增長最快的國家。僅2018年，我國共進口各類乳制品264萬噸，同比增加6.70%。其中，奶粉(含嬰幼兒配方乳粉)進口量112萬噸，同比增長10.89%，占乳制品進口總量的42.50%，進口額高達9.7億美元[2]。2008年爆發的三聚氰胺事件使中國乳品行業遭受空前的沉重打擊，消費者對國產乳制品的消費信心正艱難恢復，重整乳業需要實施嚴格的檢測和監管。而摻假技術在非法利潤的驅使下有隨著檢測技術不斷進步而不斷更新的特點，進口乳制品僅對其安全性進行評估，我國極少涉及真實性檢測，缺乏相關真實性檢測的方法。發展食品真實性檢測技術可以對食品生產者起到威懾作用，可在一定程度上重建我國消費者對國產奶粉的信心。本文主要探討乳制品摻假的現狀，對目前比較關注的穩定同位素技術在乳制品摻假鑒別中的研究進展進行闡述，并對目前技術的優劣勢進行分析，旨在為進一步完善監管和檢測技術手段提供參考。

1 乳制品摻假與檢測現狀

乳制品的摻假主要有三個方面：一是非法添加外來物(表1)，如已經被媒體公開報道過的摻水、尿素、糖、淀粉以及三聚氰胺等。這類已知的摻假方式相對容易檢測，我國有一系列檢測方法和標準，如密度法、凱式定氮法、格林試劑法、液相法等。二是偽造高品質(表2)，例如復原乳冒充液態奶，非有機奶冒充有機奶，以及為了提高表觀蛋白含量的外源氮非法添加等[3]。這些摻假現象均是針對目前已有標準“量身定制”的摻假手段，具有極強的隱蔽性。雖然目前已有標準NY/T939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》對復原乳冒充液態奶的鑒別，但該方法未上升為國家強制標準，且方法容易出現誤判[4]，未得到市場和監管部門的認可。三是產地造假(表3)，有研究表明，相較于中國品牌，消費者對歐盟品牌具有最高的購買意愿，新西蘭品牌次之[5]，因此歐洲和新西蘭奶粉可能更容易被其他產地冒充。其次，造假奶粉仍然是以真實的奶源作為原料，僅是對其價值屬性進行偽造，導致產地的鑒別比摻假復雜。近年來乳制品摻假的研究方法多局限于對已知添加物的檢測，采用的方法多為光譜法，化學法等常規方法，且對產地判別的研究并不充分，需要開發新的檢測方法對奶粉的各種摻假模式進行檢測。

表1 乳制品非法添加物的檢測方法Table 1 Detection methods of illegal additives in dairy products

表2 不同類別乳制品冒充造假的檢測方法Table 2 Detection methods of fake dairy products

表3 乳制品原產地造假的檢測方法Table 3 Detection methods of dairy products in the country of origin

2 穩定同位素摻假鑒別技術應用

2.1 穩定同位素比值的表達方式

同位素是指具有相同質子數不同中子數的元素，他們互為同位素，而穩定同位素是不具有放射性的同位素。同位素的差別通常用同位素豐度表示，同位素豐度是指某一元素的各種同位素的相對含量(以原子百分計)。一般輕元素(質子數小于27)質量數較輕的同位素的豐度占絕對優勢，較重的同位素含量極低，用絕對豐度表達其差異相對困難，并且表示方式繁瑣，所以國際上使用相對量表示同位素的富集程度[20]。計算公式為:

δ(‰)=(R樣品/R標準-1)×1 000

R樣品和R標準分別代表樣品和標準物質中的重同位素豐度和輕同位素豐度比，例如C、N、H、O穩定同位素比率可分別用δ13C、δ15N、δ2H、δ18O表示，其豐度比表現為13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O。除了這些較輕的元素外，其他相對較重的元素同位素由于具有比較接近的豐度，因此一般以相對豐度表示，如11B/10B，210Pb/208Pb以及88Sr/87Sr等[24]。

2.2 穩定同位素比值的測定方法

生命元素的穩定同位素豐度的測定需要用穩定同位素質譜(IRMS)進行測定。IRMS是通過外部設備將C、H、O、N和S等相對質量較輕的生命元素轉化成相應的氣體，再進行一定的化學反應組成特定的氣體，例如：C→CO2、N→N2、C→CO以及S→SO2。然后在離子源作用下使氣體帶電，不同質荷比的氣體成分在磁場中偏轉角度不同，最后通過法拉第杯接收不同同位素組成的成分并根據矯正過的參考氣計算其豐度和同位素比值。但近10年來光譜分析技術在水和CO2氣體同位素分析方面以其快速、低價以及簡便的特點受到了廣泛的關注。目前的主要測定方法如可調諧二極管激光吸收光譜法(tunable diode laser absorption spectroscopy, TDLAS)以及光腔衰蕩激光光譜同位素分析儀(cavity ring-down spectroscopy, CRDS)等，主要用于野外生態觀測分析[20]。重元素的穩定同位素則需要用到多接收-電感耦合等離子質譜(MC-ICP-MS)或者熱電離質譜(TIMS)，其主要原理是采用熱電離方法將同位素等離子化，質量數不同的帶電粒子通過磁場偏轉后被不同的接收器接收產生電信號，從而可對重元素的穩定同位素比值進行分析。

2.3 穩定同位素的應用原理

穩定同位素具有整合、示蹤以及指示的作用[20]。生物體的穩定同位素受到不同的生物地球化學作用，產生同位素分餾效應，根據生物體同位素自然分餾的結構實際上是生物體所處環境的“自然指紋”，進而對其進行摻假鑒別和產地溯源。穩定同位素可以反應生物和生物制品的氣候、地形、土壤等自然環境條件，生物自身的代謝，人為因素等。生物體生存期間，會與外界環境發生連續且廣泛的物質交換，動物呼吸的空氣、飲用的水、進食的食物決定了自身的同位素組成。生物體自身代謝過程也會發生同位素分餾，研究發現，生物體對特定元素的分餾遵循一定的規律，如食物被消化吸收的過程中，δ15N值會隨營養級的升高而富集，一般每營養級增加3‰～4‰，δ13C值增加0‰～1‰[21-22]。不同的元素在不同的生物化學過程中其分餾效應形成機理具有明顯的特點，這些基本的同位素分餾和變化原理為乳制品的摻假鑒別和產地溯源提供了很好的指示作用。

2.3.1碳和氮同位素 碳氮穩定同位素(12C和13C，14N和15N)技術在乳制品的產地溯源和有機奶鑒別方面具有較好的應用潛力。對于碳穩定同位素其主要原理是不同類型飼草的δ13C值不同，C3植物飼草(青草、干草、大豆等)的δ13C值較低(-22‰～-28‰)，C4植物飼草(玉米、高粱等)的δ13C值較高(-10‰～-20‰)[25]。動物在利用食物的過程中雖然存在不同程度的同位素分餾現象，但從整體上看，動物的同位素組成還是由食物的同位素組成決定，并且分餾如前所述，存在一定規律。所以，進食不同比例類型的飼草后產出的牛奶穩定同位素值會有一定差異。例如，有機牛奶和普通牛奶的區別主要就是奶牛飼養方式的不同，有機養殖過程必須放牧，奶牛進食的牧草幾乎全是C3植物，而一般工廠化牛奶生產會將奶牛集中喂養，飲食中相對價格便宜的玉米等C4植物占主要成分。這樣兩種飼養模式下奶牛產出的牛奶δ13C值有所不同，所以可以通過檢測牛奶中碳元素的同位素組成，判別有機和非有機牛奶。Bontempo[26]等通過碳穩定同位素和其他微量元素聯用準確測出意大利阿爾卑斯山不同的奶酪品種，正確率區分的概率達到94%～100%；并聯合奶酪中酪蛋白和甘油兩者的碳同位素值估算出奶牛膳食中玉米的比例；Kornexl[27]在1997年就發現利用牛奶中酪蛋白的碳氮同位素比和牛奶水的氧同位素比結合地理上的同位素的數據庫可以有效追蹤牛奶的原產地。

氮的穩定同位素有15N和14N。牛奶中的氮元素主要來自奶牛每天進食的牧草。牧草有固氮牧草和非固氮牧草，前者可以固定空氣中的氮氣(δ15N值為0‰)。研究表明，固氮植物固氮過程中氮同位素的分餾很小，因此固氮植物的δ15N值接近空氣的δ15N值，其值接近0‰[15]。非固氮牧草的氮元素來源主要為土壤中氮鹽成分，主要為硝態氮和銨態氮，植物對其吸收和同化過程有較大的同位素效應，主要變化為被吸收、同化的氮元素15N豐度比吸收、同化前富集。動物進食后，吸收利用食物中的營養成分過程中會存在明顯的氮同位素分餾，而且是有規律地富集15N，一般每營養級增加3.3‰[20]。因此，奶牛進食不同牧草，或者進食固氮和非固氮成分比例不同的牧草后，其所產牛奶的氮同位素比值信息在牛奶相應的含氮成分里有所不同。據此，將牛奶中不同成分的氮同位素比值信息與牛奶產地信息相關聯，可以對牛奶進行有效鑒別和溯源。

2.3.2氫和氧同位素 自然界中氫元素與氧元素大部分是以水的形式存在，同位素分別為H、D和16O、18O。水中氫氧同位素組成與地理位置和氣候條件有關，不同環境中水的δD和δ18O值具有顯著差異。奶牛體內的氫氧元素主要來源有：飲用水、食物以及食物中的水，其中飲用水對牛奶中水的δD和δ18O的值影響最大。飲用水進入奶牛體內，影響奶牛體液及蛋白組織的同位素組成，使奶汁中水及蛋白質中的氫氧穩定同位素比率反映生活水域的地理特性。由于植物的蒸騰作用，飼料中水的δD和δ18O值會相對偏正，進而使牛乳中水的δD和δ18O值比奶牛飲用水中略微偏正。根據文獻研究的氫氧穩定同位素分餾過程，可大致顯示牛奶生產過程中氫氧穩定同位素的變化過程(圖1)。不同季節植物飼料的含水量不同，牛奶中水的δD和δ18O值要比地表水偏正2‰～6‰[20]。如果用地下水配制復原奶，牛奶中混入不同比例的復原奶，δD和δ18O的變化會同復原奶的加入比例呈現良好線性，因此能從一定程度上進行復原奶的鑒別[30]，如ChessonL等[31]調査了美國不同地區的生牛乳、奶牛飲用水、市售乳、自來水的δD和δ18O值，發現牛乳水的δD和δ18O值與奶牛飲用水的δD和δ18O值線性關系顯著，這個發現在判定牛奶的產地中具有重大意義；Magdas等[33]對羅馬尼亞特蘭西瓦尼亞地區的牛奶同位素研究表明，牛奶的δD和δ18O值隨飲食因素出現夏季較冬季高的現象，牛奶δD和δ18O值平均比飲用水的高1‰和4.5‰，最富集重同位素的牛奶大概會出現在奶牛哺乳期的第二或第三個月。對乳制品生產過程中氫氧穩定同位素分餾機制的研究可以更好的幫助理解乳制品中氫氧穩定同位素比值與產地來源的關系。

圖1 牛奶中氫氧同位素的來源及分餾過程Fig.1 Sources and fractionation of hydrogen and oxygen isotopes in milk

2.3.3其他元素同位素 硫(S)的同位素32S和34S主要通過植物根部吸收進入食物鏈，其同位素組成具有明顯的地域特征，影響硫元素同位素組成的因素主要有：距海岸線的距離、當地的地質構造、和當地的空氣污染狀況等[34]。在進行兩種產地氣候相近，地址特點顯著不同的牛奶區分時，僅僅應用氫氧同位素不能較好地區別牛奶產地時，δ34S值有望為牛奶鑒別和溯源提供更有價值的信息。Crittenden等[34]研究發現，多種元素結合分析會大大提高牛奶產地辨別的準確率。需要注意的是，在利用硫同位素值對牛奶的原產地溯源分析時，應該綜合考慮地質、氣候、當地生態環境等多種因素，防止人為等因素干擾導致誤判，以便更好地發揮硫同位素在牛奶溯源中發揮糾正、輔助的作用。

鉛(Pb)作為溯源元素，因其物理性質穩定、存在范圍廣，較早地應用在污染源示蹤、食品產地溯源等研究中。在示蹤和溯源研究中，其檢測指標一般為207Pb/206Pb和208Pb/207Pb[35]。不同地區土壤來源，形成時間，成因機制不一樣，所含鉛同位素組成也會有較大差異，具有不同的鉛同位素標記特征，這樣的特征使鉛同位素比值成為一種“指紋”，反應含鉛物質的地理位置信息[36]。動物會從飲食中攝入一定的含鉛物質，經過代謝吸收會有一部分進入到牛奶中，所以，鉛的同位素比值信息可以反應牛奶的產地信息。另外，大氣沉降過程攜帶的鉛也會被植物吸收[15]，影響牛奶中鉛穩定同位素比值，而且來源于大氣的鉛可能要高于植物從沉積物吸收的鉛[37]，因此，牛奶中鉛同位素組成不僅包含原產地地質、氣候信息，還可以反映這一地區的污染。需要更多地了解當地的環境背景才能更好地利用鉛同位素進行牛奶的產地溯源。

鍶(Sr)的同位素中應用較多的是87Sr/86Sr，影響其值的主要因素有地質年齡、地質背景等[38]。與鉛同位素類似，鍶同位素的物理性質也非常穩定，在生物地球化學過程中不會發生明顯的同位素分餾。目前為止，還未發現鍶由巖石風化為土壤、被植被吸收利用過程中發生同位素分餾現象[39]。牛奶中鍶元素含量比鉛要高得多，所以，鍶元素同位素比值可以作為一種指示元素，判斷牛奶產地的來源[40]。Fortunato等[40]在對瑞士部分地區的奶酪產地研究中發現，鍶元素是一種更高效的溯源元素。測試精度方面，鍶同位素的分析精度要比鉛同位素高一個數量級，可以區別更細微的差別。此外，在氣候差異不大的地區，鍶同位素的判別效果顯著優于δ18O和δD。因此，鍶同位素在牛奶等農產品溯源和真偽鑒別研究領域具有巨大的潛力[41]。

表4總結了以上文中穩定同位素技術在摻假鑒別和產地溯源中的一般應用方式和影響因素。

表4 穩定同位素在摻假和產地鑒別中的應用Table 4 Application of stable isotope in adulteration and origin identification

3 乳制品摻假鑒別研究進展

現階段新型乳制品的摻假檢測方法仍然沒有上升到國家標準的層面，表明這一問題還沒有得到充分的解決。常規的摻水，摻尿素，三聚氰胺和糊精等摻假形式已經有一些檢測方法，但是復原乳冒充液態乳，牛奶中外源氮檢測，進口奶粉的產地溯源，有機乳制品的鑒別仍然無法得到有效的檢出和監管。穩定同位素技術的應用可提供可靠有效的檢測方法。

3.1 復原乳冒充鮮牛奶

復原乳是奶粉勾兌還原而成的牛奶，我國規定，低溫巴氏奶絕不允許使用復原乳。目前復原乳的主要檢測手段是高效液相色譜法檢測乳制品中的糠氨酸含量，該方法靈敏度高，但樣品前處理時間約24 h，耗時較長，前處理復雜。由于復原乳一般需要加入外來的水源，因此氫氧穩定同位素的檢測理論上可克服前處理復雜、費時長等缺點，提供可靠有效的檢測方法。Lin等[30, 42]對鮮牛奶和復原乳中水的氫氧穩定同位素進行分析指出，兩者存在顯著的差異。Ehtesham等[43]指出牛奶中的水比其飲用水富集30%的氘，且牛奶中水、固形物以及脂肪酸中的δ2H與食物和飲用水中的δ2H密切相關。這些研究均為利用氫氧穩定同位素比值鑒別復原乳冒充純牛奶提供了理論依據。另有研究表明，高溫會導致牛奶中的δ13C和δ15N發生改變，提出可通過加工類型來區分樣品的概念[18]，但該方法未有進一步的研究支撐。因此采用穩定同位素技術對鮮牛奶的摻假檢測理論上可行，但需要更多的驗證數據進一步明確檢出限、判定值以及適用范圍。除穩定同位素外，劉歡等[44-45]還報道了采用同步熒光技術檢測鮮牛奶中摻雜復原乳的研究，結合PLS-DA模型，可以實現對鮮牛奶中復原乳的定性檢測，但目前的研究對鮮牛奶中添加復原乳的定量檢測仍然無法準確實現。

3.2 外源氮的非法添加

目前乳制品中外源氮的檢測手段主要基于已知摻假物的檢測，而對于未知的氮源則無能為力，因此需要開發非靶向的外源氮檢測方法以降低企業和監管的風險。目前已經發現的摻氮類物質主要包括非蛋白氮類化合物(如三聚氰胺、尿素、銨鹽等)和非乳源蛋白類物質(如大豆蛋白，水解蛋白、乳清粉等)，其氮穩定同位素比值均有各自的分布特點。李鑫等[46]對不同國家奶粉中碳氮穩定同位素的分析表明，大部分乳粉的氮穩定同位素比值介于6‰～8‰之間，常見化工類高氮化合物如尿素、三聚氰胺δ15N為負值，因此低于此區間的奶粉樣品可能添加有外源氮。且按蛋白含量10%的比例加入三聚氰胺后，奶粉的氮穩定同位素比值由6.34‰降至5.66‰，同位素質譜分析氮穩定同位素比值的精度一般為0.2‰～0.3‰，因此該變化差異滿足乳制品中外源無機氮的識別需求，理論上可對添加10%外源氮的識別。乳制品的氮穩定同位素比值分析多用于對有機奶和非有機奶的鑒別[16]，在乳制品外源氮檢測方面的研究還比較少，需要更多的收集不同產地奶制品的氮穩定同位素比值數據，確定其真實性范圍以實現對外源氮摻假檢測的判定。

3.3 嬰幼兒配方奶粉的產地造假

自從2008年三聚氰胺事件后，我國奶粉(特別是嬰幼兒配方奶粉)進口量巨大[47]。且我國消費者更信賴歐洲，澳洲和新西蘭的配方奶粉，國產配方奶粉的信任度較低[48]。因此配方奶粉的產地造假存在較大的經濟利益，配方乳粉的產地真實性具有潛在的安全風險和監管漏洞。為了滿足嬰幼兒的營養需要，在奶粉中加入各種營養成分，以達到接近母乳的效果。與普通奶粉相比，奶粉在配方中去除了部分酪蛋白，增加了乳清蛋白；去除了大部分飽和脂肪酸，加入了植物油，DHA(二十二碳六烯酸，俗稱腦黃金)，AA(花生四烯酸)配方奶粉中還加入了乳糖，含糖量接近人乳；降低了礦物質含量，以減輕嬰幼兒腎臟負擔；另外還添加了微量元素、維生素、某些氨基酸或其他成分。因此對于嬰幼兒配方奶粉的產地溯源而言，常規的總體(bulk)穩定同位素分析以及元素分析均不完全適用。本課題組前期對200多份配方奶粉的碳氮氫氧穩定同位素進行了分析，結果表明配方奶粉的同位素變化范圍遠大于純牛奶固形物(未發表數據)，添加劑對奶粉總體同位素具有顯著的影響，但仍能在一定程度上實現不同國家配方奶粉的區分。梁莉莉等[49]利用EA-IRMS測定了酪蛋白δ13C 和δ15N 值，分析發現酪蛋白的δ13C和δ15N與產地有很大相關性，不同地區樣品有各自的地域特點。酪蛋白是配方奶粉中需要減少的，不受添加成分的干擾，可作為產地溯源指標。相比其他類別乳制品的產地溯源研究[27, 50]，配方奶粉的產地溯源方法和研究仍然較少，也是乳制品真實性鑒別的重點研究方向。

3.4 普通乳制品冒充有機乳制品

對于有機產品我國制定國標GB/T 19630和《有機產品認證實施規則》等的相關規定,但僅靠產品的有機認證難以保證有機乳制品的真實性。目前，國內沒有明確的檢測技術可以精準鑒別有機制品，難以采取有效的控制和防范措施。Ⅲ-Min Chung[15]研究發現有機牛奶的δ15N值總是比非有機牛奶的低，同一地點，不同月份的牛奶，氮同位素值有所不同。這與Molkentin & Giesemann[16]和Molkentin[29]的研究結果一致，但Bateman & Kelly[23]的研究結果卻相反。趙超敏等[51]研究發現有機奶粉的δ13C較非有機奶粉的δ13C偏負，有機奶粉的δ15N較接近。說明碳、氮穩定同位素作為有機牛奶的鑒別情況要比植物復雜的多，需要更多的考慮奶牛食物是否有機種植，飼料種植土壤的氮本底值等因素。Ⅲ-Min Chung等[52]的研究進一步指出特定化合物的同位素數據，如脂肪酸和氨基酸的同位素，在總體穩定同位素區分能力不足的情況下，可提高有機乳制品驗證的可靠性。同位素比質譜技術可能是一個很好的鑒別有機乳制品真實屬性的可靠技術，但需要更系統的研究明確有機和非有機生產的乳制品同位素分布范圍，從而實現更準確的鑒別效果。

4 小結與展望

乳制品的摻假主要是經濟利益驅動的造假現象(economically motivated adulteration, EMA)，且由低端的加水、淀粉和外源氮等加量的手段轉向低質產品冒充高質產品的增質轉變。穩定同位素技術在摻假鑒別和產地溯源中有突出優勢，該技術通過追溯和識別乳制品生產的基本生物學過程的穩定同位素變化實現真實性鑒別和產地溯源，可有效解決這些摻假問題。

同位素技術雖然能提供強大的摻假鑒別能力，但在乳制品的真實性鑒別中依然缺乏系統的理論支撐。不同的生物學過程、環境因素以及生產加工過程對乳制品穩定同位素的影響效應和機制研究仍然十分缺乏，這將導致穩定同位素技術在本領域研究缺乏系統性和推廣性。比如，1) 飼料、飲用水等生產資料與乳制品中同位素之間的關系還沒有完全理清。2) 有機與非有機奶中碳氮穩定同位素的差異仍然具有不確定性，需要更系統的實驗設計予以明確。3) 配方奶粉中外來添加物對原料奶的穩定同位素比值以及產地溯源可靠性的影響也未充分評估。這些機理的充分研究有利于制定有效、穩定的真實性鑒別技術標準，讓研究結果走向技術應用。

我國是乳制品進口大國，在進口乳制品質量安全監管、原產地識別方面具有較大的技術需求，特別是嬰幼兒配方奶粉還需要研究快速可靠的摻假和產地溯源技術方法以適應我國監管需求。而對于我國乳制品企業，該技術可運用于對原料奶和進口乳粉的非法添加以及原產地問題進行鑒別，為企業降低食品安全風險。但目前的研究僅提供了穩定同位素技術在乳制品摻假和產地溯源上的可行性，而實現真實性判定需要基于大量的數據積累，與企業聯合開展相關的研究和數據庫建設是有效的解決方案。