穩定同位素技術在牛奶及奶制品溯源應用中的研究進展

趙姍姍，謝立娜，郄夢潔，趙 燕

(中國農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081)

牛奶因含有豐富的營養物質[1-2]，廣受消費者歡迎，2018年，我國牛奶產量和乳品加工企業均排在亞洲前列，乳品進出口總額突破100億美元。2019年全國乳制品銷量更加大幅增長，成為全球最大的乳品新興市場[3-4]。隨著食品跨國界和跨地區流通越來越頻繁、牧草資源和飼料價格上漲，市場上出現奶制品良莠不齊的現象，甚至復原乳冒充鮮奶的情況。類似“三聚氰胺”事件時有發生。為此，我國在出臺的《中華人民共和國食品安全法實施條例》中規定建立健全了食品安全管理制度，通過逐步推動實行有效的追溯體系，對市場上銷售的不符合質量安全標準的食品、農產品進行追本溯源，完善了懲罰性賠償制度[5]。食品產地溯源技術的研究有利于實施食品的原產地產品保護，特色食品保護；在食品安全事件發生時，有利于快速追溯污染源頭，實施有效召回，減少經濟損失，保護消費者身體健康，實現“從農田到餐桌”的全程關注[6]。

目前應用于食品產地溯源研究技術有穩定同位素技術[7]、多元素分析技術[8]、紅外光譜技術[9]、核磁共振技術[10]等。穩定同位素技術具有精確度高、靈敏度好、無污染等特性，近年來在食品產地溯源及真實性鑒別等方面得到了長足發展和廣泛應用[11]。本文主要闡述了穩定同位素技術在牛奶及奶制品可追溯性的國內外研究進展，及對未來乳品產地溯源應用的展望，以推動穩定同位素技術在牛奶及奶制品溯源研究工作的不斷深入和完善。

1 穩定同位素技術的基本原理

同位素分餾效應是指由于元素質量數的不同，在物理、化學及生物化學作用過程中，生物體內穩定同位素以不同比值分配到兩種或兩種以上不同的物質或同一物質兩個相態的作用[11]。生物體因環境、氣候、土壤、生物代謝的影響利用從而發生同位素的自然分餾效應，導致自然物質中元素的同位素豐度呈現出顯著變化，從而使“重”、“輕”同位素比值發生變化，使得不同地理來源的生物體中穩定同位素[12]比值存在較大差異，進而反映出生物體所處的環境[13]。目前食品產地鑒別的研究中廣泛應用的穩定同位素主要為碳、氮、氫、氧、硫。

1.1 碳同位素

根據植物固定CO2的方式可分為C3、C4和CAM植物。C3植物經光合作用的三羧酸循環產生，初始產物是3-磷酸甘油酯(三碳化合物)，如水稻、小麥等。C4植物以草酰乙酸(四碳化合物)為起始產物，由二羧酸循環產生，如甘蔗、玉米等。CAM植物是具景天酸代謝途徑的植物，多為多漿液植物，如仙人球。在自然界中，碳穩定同位素有兩種，即12C、13C，12C豐度為98.89%，13C豐度為1.11%。C3植物中δ13C值變化在-34‰～-22‰之間，C4植物中δ13C值的變化在-19‰～-9‰之間，CAM植物中δ13C值變化范圍相比較寬，在-38‰～-13‰之間[14]。植物源性食品中所含碳同位素與光合作用中二氧化碳代謝途徑有關，因此，通過測定動物體內碳同位素豐度比(13C/12C)，即δ13C值，可以準確判斷動物攝入的飼料是C3植物還是C4植物，除此之外，植物源性食品中所含碳同位素還受外界環境因素的影響。研究表明，影響植物中碳穩定同位素組成的環境因素有溫度、降水、光照、壓力及大氣中CO2的碳同位素組成等，它是生物因子與環境因子共同作用的結果[14-15]，能直接反映出植物生長的地理環境。動物源性食品的碳同位素組成與動物食用的飼料息息相關，進而可以推測動物體的膳食中C3與C4植物所占比例[16-18]。

1.2 氮同位素

氮在自然界中存在14N和15N兩種穩定同位素，14N豐度為99.635%，15N豐度為0.365%，氮同位素豐度比(15N/14N)的差值表示為δ15N。不同來源的含氮物質中具有不同的氮同位素豐度。植物中δ15N值取決于土壤中的氮池(硝酸鹽和氨)，而土壤中δ15N值又取決于地理和氣候條件，并與農業施肥有關[19]。動物源性食品中氮同位素比值與動物的食物源和新陳代謝有關，除此之外還與土壤中化學肥料的使用，及飼料中動物源性成分有關[20]。

1.3 氫、氧同位素

自然界中的氫有1H(氕，H)、2H(氘，D)、3H(氚，T)三種同位素，其中1H、2H為穩定同位素，1H豐度為99.985%，2H豐度為0.015%，氫同位素豐度比(2H/1H)的差值表示為δ2H。氧在自然界中存在16O、17O、18O三種穩定同位素，16O豐度為99.759%，18O豐度為0.204%，通常用δ18O表示氧同位素豐度比(18O/16O)的差值。氫、氧元素構成水分子，與水循環的示蹤密切相關。氧穩定同位素的分餾作用主要是由于水的蒸發、濃縮和沉淀。一般而言，自然界中的氫、氧穩定同位素具有緯度效應、陸地效應、季節效應等，即隨著緯度的增加同位素比值減小；由海岸向內陸同位素比值減小；溫度高的夏季重同位素更為富集[21]。同位素的分餾信息可通過奶牛飲食傳遞到牛奶中。動物樣品中δ2H和δ18O值主要與動物飲用水及距海遠近相關，是反映地理環境的良好指標[22-23]。此外氫穩定同位素還與溫度、海拔高度和水同位素有關[24-25]。奶牛的品種也會對牛奶中δ18O值有一定影響，但其影響遠小于膳食和地域因素[26]。

1.4 硫同位素

硫元素在自然界存在32S和34S兩種穩定同位素，32S豐度為95.02%，34S豐度為4.21%，通常用δ34S表示硫同位素豐度比(34S/32S)的差值。硫元素在地質研究中較為廣泛，常用來探索地質構造及環境演化，同時它也是酸雨污染研究中的一項重要指標。土壤中硫穩定同位素組成與土壤地質、降水、農業施肥等因素有關，因而動植物體中硫穩定同位素組成與其產地來源密切相關，它能有效地表征地域來源[27-28]。

2 穩定同位素技術在牛奶及奶制品中的應用

對于不同的乳產品，同位素組成有一定差異[29]。由于受到奶牛的飼喂體系、新陳代謝、原產地的土壤地質、環境等因素的影響，牛奶及其制品中穩定同位素組成會呈現出差異，因此穩定同位素組成可以反映乳品原產地的地理環境信息。目前，許多學者對于牛奶及奶制品的產地溯源研究都有了深入的探索。作為一種有效的溯源手段，穩定同位素技術在液態奶、奶粉、奶酪、黃油等方面都有良好的應用。

2.1 液態奶

穩定同位素技術在液態奶中的研究主要集中在牛奶來源的追溯、有機牛奶等高價值牛奶的鑒別等方面。1997年，穩定同位素技術首次用于研究牛奶的地理來源[19]。到目前為止，對牛奶來源的研究已經包括許多國家。2007年，Crittenden等[30]從澳大利亞和新西蘭的七個乳業地區采集了牛奶樣本，并對其δ13C、δ15N、δ18O、δ34S、δ87Sr值進行了分析，每個牛奶樣本都顯示了不同的同位素指紋。尤其是δ18O和δ13C值，符合各地區緯度和氣候的同位素分餾模式，可見，穩定同位素技術在確定澳大拉西亞產奶制品的地理來源方面具有很好的潛力。Luo等[31]采集了大洋洲、美洲、歐洲和亞洲大陸牛奶樣品，分析了蛋白質中δ13C和δ15N值以及牛乳水中δ2H和δ18O值，發現用δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值可以對這些地區的牛奶產地進行鑒別。穩定同位素不僅可以追溯不同國家間的牛奶來源，也可以追溯同一國家不同地區的牛奶來源。Chesson等[32]檢測了美國不同地區的牛奶、市售牛奶、奶牛飲用水、自來水中δ2H和δ18O值，結果表明，產地的自來水解釋牛奶中δ2H和δ18O值不足以表征奶源產地，而牛奶和奶牛飲用水中δ2H和δ18O值呈正相關關系，可以用于牛奶產地來源研究。Chung等[33]對韓國有機牛奶中δ13C、δ15N、δ18O和δ34S值進行了測定，并建立了判別模型，該模型在保寧、高昌和濟州地區顯示出良好的預測性，發現δ13C值是最重要的影響因素。Garbaras等[34]在夏季和冬季，在白俄羅斯的布雷斯特、戈梅爾、格羅德諾、明斯克和莫吉列夫地區采集了牛奶、水和飼料，測定了牛奶中δ18O值、乳酪蛋白中蛋氨酸δ34S值和特定乳組分中δ13C和δ15N值，其中牛奶中δ18O值在不同地區發生了變化，而δ13C值在夏季和冬季不同。中國對穩定同位素技術溯源不同產地的牛奶也有報道。明荔莉等[35]通過元素分析-穩定同位素質譜儀(EA-IRMS)建立了牛奶中碳穩定同位素檢測方法，該方法的穩定性和準確性均達到了同位素比值測定的要求，結果表明，不同產地、不同品牌的牛奶中δ13C值差異顯著。此外，穩定同位素技術在羅馬尼亞[36]、馬來西亞[37]及阿根廷[38]不同地區的牛奶溯源中也起到了重要的作用。

牛奶中的穩定同位素組成與飲食有著重要的相關性。δ13C值相對低的牛奶來自以草地為主的地區，而δ13C值相對較高的牛奶來自以農作物種植為主的地區。Konbbe等[39]對6個月不同飼養條件下牛奶樣品中碳、氮穩定同位素組成進行了分析，牛奶中δ13C值取決于基于C3或C4植物的不同喂養方式，草飼條件下牛奶中δ13C值比玉米飼喂條件下的牛奶中δ13C值低，兩種喂食方式下，牛奶中δ15N值差異小于δ13C值，因為δ15N值通常反映了不同地區不同農業條件(如不同的肥料)[19, 40]。Camin等[41]以2個農場的奶牛為研究對象，以不同種類的C3植物和不同數量的玉米為飼料，研究了飼料和牛奶的穩定同位素比值(δ13C、δ15N、δ18O、δ2H)，結果表明，乳酪蛋白和脂類中δ13C與玉米在動物日糧中的比例顯著相關，但是牛奶中δ18O值和酪蛋白中δ18O、δ2H值和δ15N值不僅受飼料中玉米含量的輕微影響，還與產地的地理氣候和土壤特征以及日糧中新鮮植物或青貯飼料的存在有更密切的關系。由于飼料組成對牛奶中碳穩定同位素比值具有重要影響，因此穩定同位素技術是鑒別有機牛奶等高價值牛奶的有效手段。Molkentin等[42]通過對碳穩定同位素比值的分析，可以完全區分有機奶和常規奶。對于傳統飼養得到的牛奶，其脂肪的δ13C值為-26.6‰或者更高，而有機奶奶脂肪中δ13C值低于-28.0‰，這是由于傳統農場的基本飼料由60%的玉米青貯組成，有機農場在放牧期間只使用少量的玉米青貯，而使用較高比例的草(C3植物)[43]。穩定同位素技術也可以用于生鮮乳和復原乳的鑒別。Lin等[44]從不同季節的奶牛場采集牛奶和地下水樣品，測定了δ2H和δ18O值，研究了穩定同位素比值質譜法鑒別生乳和復原乳的可能性，結果表明，用地下水配制的復原牛奶和生鮮牛奶之間存在差異。

2.2 奶粉

奶粉是由鮮奶消毒后經濃縮、噴霧、干燥而成的。鮮奶加工成奶粉后，水分降低，蛋白質、無機鹽、脂肪等營養素占比增加。奶粉是全球最常見的牛奶交易形式，國際貿易中奶粉常被用作其他產品(如嬰兒配方奶粉、糖果)的成分，有必要建立一個溯源體系，提供有關該混合物乳制品成分來源的信息。隨著“三聚氰胺”事件的發生，近年來，我國研究人員對奶粉的研究也逐漸增多，對奶粉的穩定同位素研究大多集中于奶粉中碳、氮穩定同位素。李鑫等[45]利用元素分析儀-穩定同位素質譜儀建立了原料乳粉中δ13C和δ15N值的檢測方法，顯示出良好的穩定性和重現性。δ13C值能直觀的反映出原料乳粉地域和奶牛喂養方式的不同，可以作為原料乳粉產地來源的指示參數，而原料奶粉中δ15N值的測定可以在健全產地數據庫后起到初篩異常牛初乳的作用。不僅奶粉中的穩定同位素比值可以提供奶粉的產地信息，酪蛋白和脂肪酸中的穩定同位素比值也是重要的溯源標志指標。梁莉莉等[46]通過EA-IRMS技術測定了不同階段的嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值，研究發現δ15N和δ13C值與奶粉原產地具有相關性，且同一地區的嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的碳、氮穩定同位素分布呈正相關，而在不同地區則存在顯著差異。蘇靜[47]以不同產地及適應不同人群的15種奶粉為研究對象，測定分析了脂肪酸的碳、氫穩定同位素比值，結果表明奶粉脂肪酸中δ13C值差異在奶源的地域性上得到反映，長鏈脂肪酸中δ2H值也與地域特征有明顯關系；隨著碳鏈的延長，其13C同位素在貧化，2H同位素在富集，兩種同位素變化趨勢正好相反。相比之下，國外利用穩定同位素技術對奶粉的研究較少。Ehtesham等[48]研究了新西蘭各地的散裝奶粉和奶粉脂肪酸中δ13C和δ2H值與其產地的相關性，發現4種脂肪酸(C4∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶1)和散裝奶粉中δ13C和δ2H值與產地有關，且采用脂肪酸δ13C和δ2H的線性判別分析(LDA)模型提供了最佳的分離效果。因此，脂肪酸的同位素組成可以作為奶粉中一個很好的標志指標，通過傳遞可靠的同位素信息來追蹤奶粉的區域來源。

2.3 奶酪

穩定同位素比值也常作為奶酪產地溯源的關鍵參數。Camin等[49]對來自法國、意大利和西班牙三個國家奶酪中C、N、H、O、S穩定同位素比值進行了分析，發現酪蛋白和甘油中δ13C與奶牛飼料中玉米的含量呈正相關，甘油中δ18O值還與季節、溫度、濕度等因素有關，利用穩定同位素比值對奶酪原產地進行判別分析，判別正確率高達90%以上。Pillonel等[50]通過采集瑞士和法國的拉克雷特奶酪，證明了δ2H、δ13C、δ15N和δ34S值作為區分拉克雷特奶酪原產地指示物的潛力，根據主成分分析圖顯示，這四種穩定同位素比值很好地表征了三個區域，即瑞士、法國西北和法國中東地區。除了對不同國家奶酪樣品的鑒別，利用穩定同位素比值分析對鄰近地理區域奶酪的可追溯性也有報道。Valenti等[51]研究表明碳、氫、氧、氮和硫穩定同位素比值的變化可以區分受保護原產地(PDO)區域內附近地區生產的奶酪；其中硫和氮穩定同位素比值提供了最好的鑒別效果(97.2%的奶酪正確分類)。利用碳氮穩定同位素比值以及脂肪中的氧穩定同位素比值還可以區分來自意大利不同地區的牛羊奶酪[52]。

穩定同位素組成對來自不同地形特點的山區奶酪也有較好的區分效果。Bontempo等[53]研究了兩種典型的山地奶酪中H、C、N、O穩定同位素比值，結果表明這些穩定同位素組成與產地的植被類型、地理條件、海拔高度有密切關系，其中δ15N值與植被類型的關系更為密切，δ18O和δ2H值則與海拔高度更具有相關性。利用穩定同位素比值，可以在兩個山區的兩種不同類型的牧場中獲得樣品之間較好的區分度。相比于其他穩定同位素，碳穩定同位素更能表現出奶酪樣品的地域差異。Altieri等[54]根據碳、氮、氧穩定同位素分析了馬蘇里拉奶酪的產地，實驗表明，牛奶和奶酪中δ13C、δ15N值沒有明顯差異，表明碳和氮穩定同位素在奶酪生產過程中未發生分餾效應；δ13C值受飲食的影響，能反映出不同地域的信息，δ15N值由于會受到反芻動物新陳代謝分級調節的影響，不能準確的顯示地域差異。

2.4 黃油

利用H、C、N、O、S和Sr的穩定同位素建立真實樣本數據庫來確定盲樣地理來源，可以在實際案例中獲得準確的結果；在不同基質樣本中測量穩定同位素比值，不同實驗室之間進行比較，共同構建完善的樣本數據庫，已經成功應用到奶酪及黃油的產地溯源[55]。Rossmann等[56]采集了歐盟的不同國家及歐盟以外國家的黃油樣品，測定了黃油中δ13C，黃油蛋白中δ13C、δ15N、δ34S和δ87Sr，以及黃油水中δ18O值，結果顯示穩定同位素比值可以準確地檢測出黃油的區域來源，其中δ15N和δ34S值在黃油產地鑒別中起到尤為重要的作用。

3 穩定同位素技術結合其他溯源方法在奶制品中的應用

穩定同位素分析技術作為食品產地溯源研究的主要方法之一，與其他溯源技術結合能更快速有效的區分奶源產地及物種來源。

3.1 穩定同位素結合礦物元素

礦物元素是一項有效的食品產地溯源指標，主要是尋找與地域有關的特征元素。土壤、水、食物的礦物元素組成及含量都有其各自的特征圖譜，動物不斷的從所生活的環境中獲取各種礦物元素，導致不同地域來源的乳制品中礦物元素與當地環境中的礦物元素有較強的相關性，從而具有典型的指紋特征。檢測礦物元素含量的儀器有原子吸收光譜儀(AAS)、原子熒光光譜儀(AFS)和電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)等。其中ICP-MS由于檢測精度高、檢出限低、靈敏度高、檢測速度快、可同時檢測多種元素的特點，在食品產地溯源方面的應用日益增加。首次利用礦物元素研究乳制品的來源和品種是在1995年[57]，之后礦物元素分析被逐漸應用于乳制品的溯源研究[58-60]。

3.2 穩定同位素與化學成分的結合

脂肪酸是食品的固有屬性，能為溯源提供有效的信息，脂肪酸的組成和含量可作為食品來源鑒別指標。奶制品中不同脂肪酸含量和比率與動物的所處環境的土壤、氣候有關，同時也與飼料配比、飼養方式等因素密切相關，可以通過分析奶制品中脂肪酸的組成及含量特征對奶制品進行產地溯源研究[67-68]。Molkentin等[69-70]通過乳脂肪碳穩定同位素和脂肪酸的差異，對德國有機牛奶和常規奶進行識別，由于有機奶中α-亞麻酸(C18:3ω3)和二十碳五烯酸(C20:5ω3)含量較高，所以脂肪酸可以將有機牛奶和傳統牛奶全區別開來，而且有機奶δ13C值顯著低于常規奶δ13C值，研究還發現， C18:3ω3和δ13C之間有明顯的負相關性(r=-0.92)。Erich等[71]測定了乳蛋白、乳脂肪中碳同位素比值及α-亞麻酸含量，并用NMR對乳脂進行了分析，多維度數據結合顯著提高了德國生奶和零售奶的鑒定準確率，與單獨使用IRMS相比，分類準確率提高到95%。

氨基酸也可以用來鑒別不同地區的奶制品，游離氨基酸對于奶酪的香氣和口感至關重要，它們是由奶酪成熟過程中蛋白質水解現象形成的。Manca等[72]采集了撒丁島、西西里島和阿普利亞的羊奶干酪，測定了酪蛋白中穩定同位素比值(δ13C和δ15N)，并用高效液相色譜法測定了干酪樣品中部分游離氨基酸比值(His/Pro、Ile/Pro、Met/Pro和Thr/Pro)，應用主成分分析、聚類分析及線性判別分析方法進行多元數據處理，結果表明，對變量Ile/Pro、Thr/Pro、δ13C和δ15N進行線性判別分析后，樣品的判別正確率達到了100%。

4 總結與展望

4.1 問題及建議

穩定同位素技術也有一定局限性，除了飼料成分，物種、品種、動物代謝、氣候、環境及采樣季節都會導致乳制品中穩定同位素比值的變化，加工過程也會對乳制品同位素比值造成影響，使得小區域樣本產地鑒別難度較大。因此利用穩定同位素技術溯源牛奶及奶制品，要考慮多種因素的影響。穩定同位素技術不足以對牛奶及奶制品進行產地溯源和真實性判別時，可以選擇將穩定同位素技術與多種技術如礦物元素、化學成分分析等相結合，增加判別因子，從而得到更完整、更準確的判別結果，以實現牛奶及奶制品的產地精準溯源。

4.2 展望

穩定同位素技術在牛奶及奶制品產地溯源及真實性研究中具有獨特的作用，對乳制品產地追溯、有機乳以及復原乳的鑒別具有潛在的市場需求，但是我國對這方面的研究較少，可能是對穩定同位素在動物體內的分餾機制了解不夠深入，影響了穩定同位素技術在牛奶及奶制品產地溯源和真實性研究中的應用。未來我們可以探索飼料和飲用水中穩定同位素組成與牛奶及奶制品中穩定同位素組成的關系，研究穩定同位素比值在動物代謝中的分餾過程及影響因素，將產地、飼料、飲用水、牛奶及奶制品一一對應，加大真實樣本數據庫的建立。隨著數據庫的擴充，牛奶及奶制品產地信息的更新，溯源系統不斷完善，我國乳制品行業將迎來發展新階段。