鄰苯二甲酸酯類標準物質在嬰幼兒乳粉塑化劑檢測中的應用研究

孫 雯，李 杰，杜曉寧，徐仲杰，潘 潔，尤雅芳，李美華,*

(1.上海化工研究院有限公司，上海 200062；2.上海計量測試技術研究院，上海 201203)

嬰幼兒乳粉作為嬰幼兒除母乳之外的主要膳食營養(yǎng)來源，其產(chǎn)品質量直接影響嬰幼兒發(fā)育。嬰幼兒乳粉中的污染物主要有鄰苯二甲酸酯類增塑劑、獸藥殘留、雙酚A、壬基酚、重金屬等，主要來源于各類原輔料、生產(chǎn)過程中接觸的加工設備、管道及管道清洗所殘留的清洗劑、消毒劑，設備磨損產(chǎn)生的金屬異物，環(huán)境遷移，包裝遷移等帶入產(chǎn)品中[1-3]。其中鄰苯二甲酸酯類塑化劑可產(chǎn)生類似于雌激素的作用，在動物體中表現(xiàn)出生殖和發(fā)育毒性、誘變性、致癌性和致畸性。2011年衛(wèi)生部辦公廳關于通報食品及食品添加劑中鄰苯二甲酸酯類物質最大殘留量的函規(guī)定食品、食品添加劑中的鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)和鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)最大殘留量分別為1.5 mg/kg、9.0 mg/kg和0.3 mg/kg。我國在2017年6月頒布實施的食品安全領域國家標準 GB 5009.271—2016《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》中規(guī)定對食品中可能殘留的16種鄰苯二甲酸酯的含量采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行檢測，同位素內標法或外標法定量[4]。近年來，國內關于鄰苯二甲酸酯檢測技術研究也大多采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法，由于考慮到測試成本，目前塑化劑的檢測大多采用外標法[5-10]。據(jù)文獻報道[1,6]，外標法測定嬰幼兒乳粉中16中鄰苯二甲酸酯類遷移物其回收率為75.0%～107.6%，在外標法測定松茸中18種鄰苯二甲酸酯時回收率為80.23%～118.0%。穩(wěn)定同位素內標的使用，可消除基質干擾，大大提高分析結果的準確性，有效避免痕量檢測中假陽性現(xiàn)象的發(fā)生。目前，越來越多的國家標準使用同位素稀釋質譜法，如食品中農(nóng)殘、硝基呋喃類代謝物、黃曲霉素等的檢測中均采用相應的穩(wěn)定同位素標記化合物做內標。實驗表明，同位素內標的使用消除了基質效應對檢測產(chǎn)生的影響，提高了檢測方法的回收率。

本研究依據(jù)16種鄰苯二甲酸酯在氣相色譜-質譜聯(lián)用儀中保留時間的差異，選取6種自制的氘標記鄰苯二甲酸酯做內標，對嬰幼兒乳粉中16種塑化劑進行定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：配備自動進樣器和EI離子源，Trace1310 ISQ型，美國Thermo Fisher公司；電子天平：MSA225S型，賽多利斯科技有限公司；超聲波清洗儀：KQ-300VDE型，昆山市超聲儀器有限公司；冷凍離心機：CT14RDⅡ型，上海天美；純水儀：Milli-Q，德國Merck公司；正己烷：色譜純，德國Merck公司；16種鄰苯二甲酸酯標準品：純度≥98%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；6種氘標記鄰苯二甲酸酯內標：苯環(huán)標記，純度>98.5%，同位素豐度>99.0atom%D，上海化工研究院有限公司；檢測樣品為8種不同品牌嬰幼兒乳粉。

1.2 16種鄰苯二甲酸酯混合標準溶液的配制

1.2.116種鄰苯二甲酸酯標準儲備液(1 000 μg/mL) 準確稱取16種鄰苯二甲酸酯標準品各10 mg(詳細信息見表1)，分別置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解，定容至刻度，得到濃度為1 000 μg/mL的標準儲備液。

1.2.216種鄰苯二甲酸酯標準中間液(10 μg/mL) 分別準確移取16種鄰苯二甲酸酯標準儲備液(1 000 μg/mL)100 μL至10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻。

1.2.36種鄰苯二甲酸酯-D4內標儲備液(1 000 μg/mL) 準確稱取6種鄰苯二甲酸酯-D4各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解，定容至刻度，得到濃度為1 000 μg/mL的內標儲備液。

1.2.46種鄰苯二甲酸酯-D4內標中間液(10 μg/mL) 分別準確移取6種鄰苯二甲酸酯-D4內標儲備液(1 000 μg/mL)100 μL至10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻。

1.2.516種鄰苯二甲酸酯標準系列工作液

準確移取16種鄰苯二甲酸酯標準中間液(10 μg/mL)，用正己烷逐級稀釋，配制成濃度為 0.00 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL的標準系列溶液，同時加入內標中間液(10 μg/mL)，使內標濃度均為 0. 125 μg/ mL。

表1 16種鄰苯二甲酸酯及其內標的信息Table 1 Information on 16 phthalates and isotopic internal standard

1.3 樣品前處理

準確稱取乳粉樣品0.5 g(精確至0.1 mg)于25 mL玻璃離心管中，加入125 μL 6種鄰苯二甲酸酯-D4內標中間液(10 μg/mL)，加入2.5 mL超純水，混勻，準確加入10 mL正己烷，劇烈振搖1 min，超聲提取30 min，1 000 r/min離心5 min，取上層清液，進GC-MS分析。

1.4 GC-MS測試條件

1) 氣相色譜。色譜柱： TRACE TG-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣：氦氣；流速：1.0 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流；進樣口溫度：260 ℃；柱溫：60 ℃保持1 min，20 ℃/min至220 ℃保持1 min，5 ℃/min至250 ℃保持1 min，20 ℃/min至290 ℃，保持7.5 min。

2) 質譜。離子源：EI源；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度：290 ℃；電離能量：70 eV；掃描模式：選擇離子掃描(SIM)，16種鄰苯二甲酸酯相應定性、定量離子及同位素內標信息詳見表2。

2 結果與討論

2.1 16種鄰苯二甲酸酯及嬰幼兒乳粉樣品SIM模式譜圖

本文根據(jù)16種鄰苯二甲酸酯保留時間的差異，選擇6種氘標記鄰苯二甲酸酯內標試劑，按照1.2、1.3節(jié)方法進行標準溶液配制及樣品前處理后，在1.4節(jié)的色譜質譜分析條件下分離16種鄰苯二甲酸酯的結果示于圖1，嬰幼兒乳粉樣品測試結果如圖2所示，圖2中保留時間為7.54、10.71、11.61、14.45、16.83、17.05 min處色譜峰為所加入6種鄰苯二甲酸酯-D4內標。

表2 16種鄰苯二甲酸酯及其相應內標的定性、定量離子Table 2 16 phthalates and their corresponding internal standard of qualitative and quantitative ions

圖1 16種鄰苯二甲酸酯及6種鄰苯二甲酸酯-D4內標SIM模式譜圖Fig.1 SIM mode chromatogram of 16 phthalates and 6 phthalates-D4internal standard

2.2 方法線性范圍和檢出限

1.2.4中配制的16種鄰苯二甲酸酯標準系列工作液，經(jīng)GC-MS分析后，分別以16種鄰苯二甲酸酯的濃度與相應內標的濃度比為橫坐標，峰面積響應值比為縱坐標，進行線性擬合，得到標準曲線回歸方程及相關系數(shù)。各組分在0.02 μg/mL～1.0 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999。利用信噪比S/N=3、S/N=10分別計算方法的檢出限、定量限。所建立檢測方法的回歸方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限列于表3。

圖2 嬰幼兒乳品中鄰苯二甲酸酯SIM模式譜圖Fig.2 SIM mode chromatogram of phthalates in infant milk products

表3 16種鄰苯二甲酸酯回歸方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限Table 3 Regression equation, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 16 phthalates

2.3 方法回收率和精密度

向未檢出鄰苯二甲酸酯的嬰幼兒乳粉中分別添加0.05、0.1、0.5、1.0 μg/mL 3個水平的鄰苯二甲酸酯標準溶液，按照1.3所述方法進行樣品前處理，每個添加水平做6個平行實驗，計算回收率和相對標準偏差，結果列于表4。由表4可以看出，在實驗所選取的樣品基質中，3個不同濃度標準品添加水平的回收率在90.8%～103.6%之間，且相對標準偏差均小于4%。

表4 16種鄰苯二甲酸酯檢測方法回收率及相對標準偏差(n=6)Table 4 Recovery and relative standard deviation of 16 phthalate detection methods

2.4 嬰幼兒乳粉樣品測試

采用同位素內標法對市售8個品牌的嬰幼兒乳粉樣品中16種鄰苯二甲酸酯進行了檢測，結果顯示只有一種品牌乳粉中檢出了鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)，含量為0.736 mg/kg。可能由于鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯在工業(yè)中應用較為廣泛，在乳粉生產(chǎn)、儲存過程中發(fā)生遷移所致。

3 小結

本文使用自制的6種氘標記鄰苯二甲酸酯做內標對嬰幼兒乳粉中16中鄰苯二甲酸酯進行定量分析。乳粉中加入一定量同位素內標，用超純水溶解后，正己烷提取，進GC-MS分析。實驗表明，基質空白加標在0.05 μg/mL～1.0 μg/mL范圍內時回收率為90.8%～103.6%，同外標法相比回收率有明顯提高，同位素內標試劑的使用有效消除了基質效應對檢測產(chǎn)生的影響，同時使用自制同位素內標試劑代替進口試劑，有助于解決過度依賴進口試劑可能遇到的“卡脖子”問題。