植物湯料紅絲線的抗氧化及抑制亞硝化作用

張超 ，談火群，羅曉東，莊遠杯 ，謝華松，張聲源 *

1. 嘉應學院醫學院（梅州 514031）；2. 梅州市工程技術研究中心（梅州 514031）

人在進行生命活動時不斷產生的活性氧（ROS）和自由基會使細胞和機體處于氧化應激狀態（oxidative stress），這是引起衰老和產生許多疾病產生的重要因素[1]。正常生理代謝活動中，人體自身的抗氧化系統會自動消滅自由基，但當機體長期處于氧化壓力狀態時，便會面臨諸多慢性炎性疾病的風險，如類風濕性關節炎、高血壓、肥胖、動脈粥樣硬化、肌肉萎縮等疾病[2]。在這種情況下，及時補充抗氧化劑來清除過多的自由基，緩解自由基對機體造成的損傷，對于許多自由基引起的衰老和相關疾病都能夠很好地預防。生活中大多的化學合成抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯（BHT）、丁基羥基茴香醚（BHA）等，雖然具有很好的抗氧化能力，但同時對人體也有一定的毒性和致癌作用[3]，故其在人體中并無應用，只作為工業抗氧化防腐劑使用，加上天然抗氧化劑具有來源廣泛、抗氧化活性強、易吸收和安全性高等優點，開發天然抗氧化劑越來越受到關注。

N-亞硝基化合物是一種致癌性很強的化合物，已研究的近300種N-亞硝基化合物中，90%以上具有動物致癌性，并證明N-亞硝基化合物可在體內外由其前體物胺類與硝酸鹽或亞硝酸鹽形成[4]。亞硝酸鹽是自然界中普遍存在的一類含氮無機化合物，可作為食品添加劑應用于肉制品中，起到護色、增色、增味、防腐等作用，但亞硝酸鹽是一把雙刃劍，為食品加工帶來效益的同時，也可因一次性攝入過量亞硝酸鹽引起中毒甚至死亡[5]。另外，亞硝酸鹽被人食用后，會在人體內形成亞硝胺，而亞硝胺是一種強烈致癌物質，會引起食道、胃、肝和大腸等部位的癌癥[6-8]。人體從食物中攝入的亞硝胺量極少，但是形成亞硝胺的前體物質亞硝酸鹽和胺類卻大量存在于硝酸鹽或亞硝酸鹽含量較高的腌制肉制品、泡菜及變質的蔬菜等食物中，以及產生于食物在體內的代謝過程中[9]。胃是適合亞硝基化反應的有利場所，人體攝入亞硝酸鹽和胺類化合物后，兩者就會在胃內進行亞硝化反應，直接生成亞硝胺，所以阻斷或減少亞硝胺的生成是預防亞硝胺所致癌癥的有效途徑[10]。

紅絲線是爵床科觀音草屬植物觀音草（Peristrophe bɑphicɑ（Spreng）Bremek）的干燥全草，又名野靛青、山藍、紅蘭草、青絲線等，主要分布于印度、東南亞國家及中國南部，為廣西壯族自治區特色食品——紅蘭酒的原料，也是東南亞及我國西南少數民族傳統的食用染料植物，全草有清肺熱、涼血止血、活血化瘀、消腫止痛等作用，作為一種民間草藥，其常用于止咳祛痰和治咯血、跌打損傷等癥[11]。據《常用中草藥手冊》記載，紅絲線具有“淡涼，散瘀、止血，治跌打淤腫、急性扭挫傷、內傷咳血”的作用。《全國中草藥匯編》中對紅絲線的描述為：“甘、淡、涼。清肺止咳，散瘀止血。治肺結核咯血、肺炎、糖尿病、跌打損傷腫痛。”多項研究表明，紅絲線具有多種活性成分，如生物堿、萜類、有機酸、黃酮類化合物、揮發油、脂肪族化合物及微量元素等化學物質[12-14]。紅絲線是梅州客家地區常見藥膳原料，口感鮮美，具清肺瀉火、消腫解毒等多種功效，民間多用于小兒高熱，驚風等；其藥食兩用的科學內涵至今尚未明確，嚴重制約其進一步開發利用。

就國內外來看，對紅絲線的研究集中于其化學成分及藥理活性、不同提取物、毒理學和生藥學研究等[15-18]，楊朝竣等[19]證實紅絲線中的色素具有較好的抗氧化活性，而對紅絲線抑制亞硝化作用的研究卻鮮見有報道。試驗采用DPPH法、ABTS法和普魯士藍法評價紅絲線提取物不同溶劑萃取部位的抗氧化作用，并在模擬人體胃液的條件下采用鹽酸萘乙二胺法和α-萘胺法分別測定紅絲線提取物對亞硝酸鹽的清除率和對亞硝胺合成的阻斷率，從而對其抗氧化能力及抑制亞硝化作用進行研究分析，以期為紅絲線的進一步開發利用提供試驗數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅絲線干品于2018年5月購自梅州市梅江區，經嘉應學院醫學院張聲源副教授鑒定為爵床科觀音草屬植物觀音草（Peristrophe bɑphicɑ（Spreng）Bremek）的干燥全草，標本存放于嘉應學院醫學院天然藥物標本館。

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（美國Sigma公司）；亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、二甲胺、1-萘胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；維生素C（西隴科學有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；BT125D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；N-1100V型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；WJX-A1000型高速多功能粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司）；WFT-203B三用紫外線分析儀（上海精科實業有限公司）；HH-2A恒溫水浴鍋（常州潤華電器有限公司）。

1.3 樣品制備

取紅絲線干燥樣品2.0 kg粉碎后，90%乙醇溶液超聲提取3次（45 ℃，200 W，30 min），減壓濃縮后加水散開成混懸液，依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取濃縮，分別制得紅絲線的石油醚部位24.7 g（P-P）、乙酸乙酯部位10.3 g（P-E）、正丁醇萃部位16.5 g（P-B）、水部位86.8 g（P-W）。

1.4 體外抗氧化作用研究

1.4.1 DPPH法

DPPH自由基清除能力測定參考文獻[20]，分別精密吸取100 μL不同質量濃度的樣品和VC溶液，并分別加入于3.9 mL 1 mmol/mL DPPH無水乙醇溶液中，避光反應20 min，以無水乙醇溶劑做空白對照，在517 nm波長處測量其的吸光度（Ai）；測定3.9 mL 1 mmol/mL DPPH無水乙醇溶液與100 μL無水乙醇混合后在波長517 nm處的吸光度（A0）；測定3.9 mL無水乙醇溶液與100 μL樣品溶液在波長517 nm處的吸光度（Aj），每個樣品平行測定3 次。根據式（1）計算各樣品對DPPH自由基的清除率。

1.4.2 ABTS法

ABTS自由基清除能力測定參考文獻[21]，將2.45 mmol/mL過硫酸鉀與7.0 mmol/mL ABTS溶液進行體積1︰1混合后避光放置16 h制備得ABTS母液，用0.01 mol/mL磷酸緩沖溶液（pH 7.4）稀釋ABTS母液，得到在734 nm波長處的吸光度0.70±0.02的ABTS工作液。分別將100 μL不同質量濃度的樣品和VC溶液加入3.9 mL ABTS工作液中，振蕩30 s，在室溫條件下放置10 min，在734 nm波長下測定其吸光度（Ai）。使用同樣方法在波長734 nm處測定3.9 mL ABTS工作液與100 μL無水乙醇混合后的吸光度（A0）。同法在波長734 nm處測定3.9 mL 0.01 mol/mL磷酸緩沖溶液與100 μL樣品溶液的吸光度（Aj），每個樣品平行測定3次。根據式（2）計算各樣品對ABTS自由基的清除率。

1.4.3 普魯士藍法

普魯士藍法的測定參考文獻[22]，并做適當修改。分別精密移取2.0 mL不同質量濃度的樣品和VC溶液于10 mL試管中，再分別加入2.0 mL磷酸緩沖液（2.0 mol/mL，pH 6.6）和2.0 mL 1%鐵氰化鉀，搖勻，于50 ℃恒溫水浴20 min后取出急速冷卻，再分別加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液。將上述溶液離心10 min（6 000 r/min），取上清液2.0 mL，加入1.5 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1% FeCl3混勻，靜置10 min后于波長700 nm處測定吸光度，每個樣品平行測定3次，吸光度越大，還原能力越強。

1.5 抑制亞硝化作用研究

1.5.1 鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽清除率

鹽酸萘乙二胺法亞硝酸鹽清除率的測定參考文獻[23]，并做適當修改。取不同質量濃度的樣品和VC溶液1.0 mL于25 mL比色管中，分別加入pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液2.0 mL、5 μg/mL亞硝酸鈉溶液2.0 mL，充分混勻后37 ℃水浴1 h，加入0.4%對氨基苯磺酸2.0 mL，混勻，靜置3～5 min，各加1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液。定容靜置15 min后在波長538 nm下測定吸光度（Ai），同時測定空白對照組的吸光度A0和樣品溶液對照組Aj，每個樣品平行測定3次。根據式（3）計算各樣品對亞硝酸鹽的清除率。

1.5.2α-萘胺法測定亞硝胺合成阻斷率

α-萘胺法測定亞硝胺合成阻斷率參考文獻[24]，并做適當改動。取不同質量濃度的樣品和VC溶液5.0 mL于25 mL比色管中，分別加入pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液10.0 mL、1 mmoL/L NaNO溶液1.0 mL、

21 mol/L二甲胺溶液1.0 mL，定容后37 ℃水浴1 h。取上述溶液1.0 mL于培養皿中，加入0.5% Na2CO3溶液0.5 mL，于紫外分析儀上用波長254 nm紫外光照射15 min。取出后分別加入1%對氨基苯磺酸1.5 mL、0.1%α-萘胺1.5 mL和蒸餾水0.5 mL，搖勻后靜置15 min，在最大吸收波長525 nm處測定吸光度（Ai），同時測定空白對照組的吸光度A0和樣品溶液對照組Aj，每個樣品平行測定3 次。根據式（4）計算各樣品對亞硝胺合成的阻斷率。

1.6 數據處理

試驗結果所得試驗數據以均數±標準差（±s）表示，通過Origin 8.5和SPSS 24.0進行處理分析，計算IC50值，采用單因素方差法進行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 體外抗氧化試驗

2.1.1 對DPPH自由基的抑制作用

紅絲線不同溶劑萃取部位對DPPH自由基的清除率測定結果及IC50見圖1和表1。由圖1可知，在試驗濃度范圍內，紅絲線各萃取部位對DPPH自由基均具有一定程度的清除作用，清除率隨質量濃度增大而增大，呈一定量效關系，對DPPH自由基的清除能力順序依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P。據表1可知，P-E清除DPPH自由基的IC50值最低（0.052 4±0.004）mg/mL，表明紅絲線清除DPPH自由基的活性物質主要集中在乙酸乙酯部位。但紅絲線4個萃取部位對DPPH自由基的清除能力仍然弱于陽性對照VC（IC50=0.04±0.001 mg/mL，p＜0.05）。

圖1 紅絲線各萃取部位對DPPH自由基清除能力的影響

表1 紅絲線各萃取部位清除DPPH自由基的IC50值

2.1.2 對ABTS自由基的抑制作用

紅絲線不同溶劑萃取部位對ABTS自由基的清除率測定結果見圖2和表2。由圖2可知，4個萃取部位對ABTS自由基的清除能力呈現量效關系，P-E對ABTS自由基的清除能力最強，P-B與P-W對ABTS自由基的清除能力接近，清除率由高到低依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P。由表2可知，P-E對ABTS自由基清除能力比其他3個極性要強，但4個萃取部位對ABTS自由基的清除能力仍然弱于陽性對照VC（IC50=0.033±0.003 mg/mL，p＜0.05）。

圖2 紅絲線各萃取部位對ABTS自由基清除能力的影響

表2 紅絲線各萃取部位清除ABTS自由基的IC50值

2.1.3 對鐵離子的還原能力

通過還原力強弱評價樣品抗氧化作用，由圖3可知，P-E的鐵還原能力最強（578.812±32.344）mmol VC/g。紅絲線各提取物對鐵離子的還原能力順序依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P，P-E對鐵的還原能力顯著大于其他萃取部位，表明紅絲線對鐵還原能力的活性物質主要集中在乙酸乙酯部位。

圖3 紅絲線各萃取部位對鐵還原能力的影響

2.2 體外抑制亞硝化作用結果

2.2.1 對亞硝酸鹽的清除能力

據圖4可知，在模擬人體胃液條件下，紅絲線4個萃取部位對亞硝酸鹽表現出一定程度的亞硝酸鹽清除作用，且清除率在試驗濃度的范圍內隨質量濃度增大而增強，但不同萃取部位的清除能力存在較大差異，質量濃度相同時（10 mg/mL），P-E對亞硝酸鹽的清除率超過80%，顯示出最強的亞硝酸鹽清除作用。由表3可知，各萃取部位清除亞硝酸鹽能力大小依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P，P-E清除亞硝酸鹽的IC50值為（2.590 9±0.130）mg/mL，遠小于其他部位，表明4個萃取部位中乙酸乙酯部位對亞硝酸鹽的清除能力最強，其次是石油醚層，IC50值為（3.480±0.265）mg/mL，但仍大于陽性對照VC（IC50=1.480 2±0.022，p＜0.05）。

圖4 紅絲線各萃取部位對亞硝酸鹽清除能力的影響

表3 紅絲線各萃取部位清除亞硝酸鹽的IC50值

2.2.2 亞硝胺合成的阻斷能力

紅絲線不同溶劑萃取部位對亞硝胺合成的阻斷率測定結果見圖5和表4。由圖5可知，模擬人體胃液條件下，阻斷率隨濃度呈正相關。在質量濃度20 mg/mL，P-E和P-B對亞硝胺的阻斷率分別達到81.65%和77.19%，大于P-E（37.29%）和P-P（22.97%），表現出良好的亞硝胺合成阻斷作用。如表4所示，P-E和P-B的IC50最低，但仍大于陽性對比VC，表明紅絲線阻斷亞硝胺合成的活性物質主要集中在乙酸乙酯層和正丁醇層，但二者存在差異。

圖5 紅絲線各萃取部位對亞硝胺合成阻斷能力的影響

表4 紅絲線各萃取部位阻斷亞硝胺合成的IC50值

3 結論

試驗首次對紅絲線的抗氧化、抑制亞硝化作用進行較為系統的探究，將為紅絲線藥材質量標準的建立、藥理活性研究提供物質基礎和科學依據。抗氧化和抑制亞硝化結果顯示，紅絲線不同溶劑萃取部位均具有一定抗氧化能力和抑制亞硝化能力。綜合DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力的試驗結果，4個不同極性組分抗氧化活性大小為：P-E＞P-B＞P-W＞P-P，因此從整體上看，紅絲線萃取組分中，乙酸乙酯組分（P-E）的抗氧化能力最強。與此同時，綜合亞硝酸鹽的清除能力和亞硝胺合成阻斷能力2種體系評價結果，紅絲線不同極性組抑制亞硝化能力依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P，乙酸乙酯組分（P-E）有比較好的亞硝酸鹽清除作用。因此，可以針對抗氧化和抑制亞硝化作用評價的結果，對紅絲線做進一步研究，為深入開發這一梅州特色藥食兩用植物提供理論依據。